一种唾液中巴豆醛‑DNA加合物的测定方法技术

一种唾液中巴豆醛‑DNA加合物的测定方法，即唾液中Propano‑dG的测定方法，包括采用OG‑500唾液采集管收集唾液，对唾液进行DNA提取，DNA溶液进行酶水解并依次加入稳定同位素内标和DNA水解酶。水解液经Strata‑X小柱固相萃取，收集洗脱液，室温下氮吹至干，复溶于甲醇水溶液，引入LC‑MS/MS系统分析，可准确检测出Propano‑dG加合物的含量水平。本发明专利技术采用稳定同位素作为内标定量分析物可以减少样品前处理过程中引起的误差，串联质谱法更好的提高了方法的选择性、准确性和灵敏度。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间，减少了有机溶剂的消耗量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于唾液样本的理化检验
，主要涉及唾液中1,N2-丙醇-鸟嘌呤（Propano-dG）加合物的测定
，具体说是一种采用液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）测定唾液中巴豆醛-DNA加合物的方法。
技术介绍
巴豆醛是一种广泛存在于环境基质中的污染物，如工业生产、机动车尾气和卷烟烟气等；巴豆醛为可疑的人类致癌物，性质较活泼，易于鸟嘌呤上的碱基发生迈克尔加成-关环反应形成环外加成产物1,N2-丙醇-鸟嘌呤（Propano-dG），该加合物可抑制DNA的合成并导致错译。唾液是一种非侵入式的样本采集方式，对受试者不造成影响样本易获得，是现成可用的DNA来源。口腔是烟气等有害成分直接暴露的靶器官，相关研究表明唾液中DNA的损伤与口腔癌相关。唾液中较丰富的细胞类型为口腔上皮细胞与白细胞，因其生命周期较短，唾液中DNA加合物的含量更加能显示致癌物的近期暴露情况，唾液在检测卷烟和食品致癌物产生的DNA加合物方面具有很大的应用前景。目前，关于DNA加合物的分析检测方法报道的较多，主要有32P-后标记技术、酶联免疫技术（ELISA）、高效液相色谱法（HPLC-UV）和液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）。其中LC-MS/MS由于其较高的灵敏度和选择性被广泛应用于DNA加合物的检测分析。
技术实现思路
本专利技术的目的正是基于上述现有技术状况而采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术建立的唾液中巴豆醛-DNA加合物（Propano-dG）的测定方法。该方法具有快速、准确、灵敏度高等特点，可用于唾液中巴豆醛-DNA加合物的定性定量分析。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种唾液中巴豆醛-DNA加合物的测定方法，即Propano-dG的测定方法，包括以下具体步骤：a、唾液采集：用Oragene·DNA唾液采集器（OG-500）对人体唾液进行标准化采集。b、唾液DNA的提取：Oragene唾液混合液于50℃水浴孵育至少1h后，加入Oragene 净化液，涡旋振荡，冰浴孵育10 min；于室温下离心；移取上层清液于一新的微量离心管中，加入纯乙醇，轻轻震荡数秒；静置使DNA分子完全沉淀，离心并去上清液；加入70%的乙醇水溶液清洗DNA团块。用超纯水复溶DNA。用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位（OD）相当于50 μg/mL。c、DNA的酶水解及纯化富集：将上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl2缓冲液（pH=7）中，加入20 μL的[15N5]Propano-dG内标溶液和30U脱氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和15U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h。水解液经Strata-X固相萃取，收集洗脱液液氮吹至干，复溶于100 μL 30%甲醇水溶液，即为样品待测液。此过程的目的是为了使双链DNA酶解成单核苷酸状态，通过固相萃取和氮吹浓缩纯化分离并富集所需的DNA加合物。所述的内标溶液为10 ng/mL的 [15N5]Propano-dG。d、标准工作液的配制：用甲醇分别配制不同浓度的Propano-dG标准工作溶液。e、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。色谱条件：选取Thermo AcclaimTM Polar Advantage II C18 色谱柱（4.6×150 mm，3 μm），流动相体系选取A：0.01%甲酸甲醇和B：10 mM乙酸铵水溶液，洗脱条件为梯度洗脱：0-2 min：25% A，2-17 min：35% A，17-25 min：25% A；流速为0.38 mL/min。分析时间为25 min，进样量为5 μL。质谱条件：电喷雾离子源（ESI），多反应监测正离子扫描方式；喷雾电压：5500 V，离子源温度：550℃，气帘气的量为20 psi，雾化气为70 psi，干燥气为75 psi，碰撞气为9 psi，射入电压：10 V, 碰撞能：9 eV，驻留时间：100 ms。监测离子对为Propano-dG：338.3→222.1定量离子对，338.3→117.2定性离子对；内标[15N5]Propano-dG为343.2→227.2。本专利技术方法的线性范围和检出限：将系列标准工作溶液注入LC-MS/MS，得到标准工作曲线、线性回归方程以及相关系数。Propano-dG标准曲线的点为0.02，0.05，0.1，0.2，0.3，0.5，1.0和2.0 ng/mL。目标物的线性回归方程为y=0.648x-0.00416，相关系数大于0.9990。利用加标稀释得到方法的定量限和检出限，目标峰十倍信噪比对应的浓度为定量限LOQ，三倍信噪比对应的浓度为检出限LOD，该方法对应Propano-dG的LOQ和LOD分别为0.017 ng/mL 和0.006 ng/mL。本专利技术方法加标回收率和重复性：采取唾液DNA样本中加标的方法获得方法的加标回收率，总共选取了三个添加水平，每个添加水平重复测定3次，得到的方法的回收率和重复性，结果见表1。目标物的回收率在88.4%-105.0%之间，RSD小于10%，证明方法的准确性和重复性结果较好。表1 分析物的加标回收率和重复性本专利技术的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对唾液中巴豆醛-DNA加合物的色谱条件进行了优化，并对LC-MS/MS的相关检测条件进行了优化。与现有技术相比本专利技术方法具有如下优良效果：①与传统的液相色谱方法比较，由于选取了串联质谱，使得方法的选择性和灵敏度提高，更有利于唾液中低含量的巴豆醛-DNA加合物的测定。②本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。③本专利技术方法采用稳定同位素作为内标定量分析物可以减少样品前处理过程中引起的误差，串联质谱法更好的提高了方法的选择性与准确性和灵敏度。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间，减少了有机溶剂的消耗量。附图说明图1实际唾液样本中巴豆醛-DNA加合物及其内标的色谱图。具体实施方式本专利技术以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本专利技术。一种唾液中巴豆醛-DNA加合物的测定方法，其测试过程是用OG-500唾液采集管收集唾液，对唾液进行DNA提取，DNA溶液进行酶水解并依次加入稳定同位素内标和DNA水解酶。水解液经Strata-X小柱固相萃取，收集洗脱液，室温下氮吹至干，复溶于100 μL的30%甲醇水溶液，引入LC-MS/MS系统进行分析。实例1：1.仪器与试剂：AB SCIEX 三重四级杆串联质谱仪（美国加州应用生物系统公司），Agilent 1200高效液相色谱（美国安捷伦公司），NanoDrop 2000超微量分光光度计（美国赛默飞科技公司），恒温培养箱（美国赛默飞科技公司），氮气浓缩干燥仪（瑞典拜泰齐公司），Milli-Q水纯化系统（德国默克集团），Analyst 1.5.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种唾液中巴豆醛‑DNA加合物的测定方法，即唾液中1,N2‑丙醇‑鸟嘌呤（Propano‑dG）的测定方法，其特征在于：包括以下具体步骤：a、唾液采集：用Oragene·DNA唾液采集器（OG‑500）对人体唾液进行标准化采集；b、唾液DNA的提取：Oragene唾液混合液于50℃水浴孵育至少1h后，加入Oragene 净化液，涡旋振荡，冰浴孵育10 min；于室温下离心；移取上层清液于一新的微量离心管中，加入纯乙醇，轻轻震荡数秒；静置使DNA分子完全沉淀，离心并去上清液；加入70%的乙醇水溶液清洗DNA团块；用超纯水复溶DNA；用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位（OD）相当于50 μg/mL；c、DNA的酶水解及纯化富集：将上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris‑HCl/5 mM MgCl2缓冲液中；加入20 μL内标溶液和30U脱氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和15U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h，水解液经Strata‑X固相萃取，收集洗脱液液氮吹至干，复溶于100 μL 30%甲醇水溶液，即为样品待测液；d、标准工作液的配制：用甲醇配制不同浓度的1,N2‑丙醇‑鸟嘌呤（Propano‑dG）标准工作溶液；e、液相色谱‑串联质谱（LC‑MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液，注入LC‑MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。...

【技术特征摘要】
1.一种唾液中巴豆醛-DNA加合物的测定方法，即唾液中1,N2-丙醇-鸟嘌呤（Propano-dG）的测定方法，其特征在于：包括以下具体步骤：a、唾液采集：用Oragene·DNA唾液采集器（OG-500）对人体唾液进行标准化采集；b、唾液DNA的提取：Oragene唾液混合液于50℃水浴孵育至少1h后，加入Oragene 净化液，涡旋振荡，冰浴孵育10 min；于室温下离心；移取上层清液于一新的微量离心管中，加入纯乙醇，轻轻震荡数秒；静置使DNA分子完全沉淀，离心并去上清液；加入70%的乙醇水溶液清洗DNA团块；用超纯水复溶DNA；用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位（OD）相当于50 μg/mL；c、DNA的酶水解及纯化富集：将上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl2缓冲液中；加入20 μL内标溶液和30U脱氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和15U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h，水解液经Strata-X固相萃取，收集洗脱液液氮吹至干，复溶于100 μL 30%甲醇水溶液，即为样品待测液；d、标准工作液的配制：用甲醇配制不同浓度的1,N2-丙醇-鸟嘌呤（Propano-dG）标准工作溶液；e、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈欢，侯宏卫，胡清源，刘鲁娟，张小涛，付亚宁，韩书磊，
申请(专利权)人：国家烟草质量监督检验中心，
类型：发明
国别省市：河南;41