一种用变色酸衍生物比色测定血清镁的方法技术

一种比色法测定血清镁的方法。原有的比色测定血清镁的方法是Ｃａｌｍａｇｉｔｅ法和ＭＴＢ法，但测度分辨力低，精度较差。本发明专利技术方法采用２－（８’－羟基喹啉－５’－磺酸－７’－偶氨）－变色酸（８Ｑ↓［５］ＳＡＣ）作为金属离子粘合剂，在碱性缓冲介质中与血清镁络合呈色，以聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）和ＯＰ乳化剂作抗蛋白干扰剂和反应增色剂，波长５４１ｎｍ处有一主吸收峰，以ＥＧＴＡ掩蔽血清钙，反应液吸光度与镁浓度０－３ｍｍｏｌ／Ｌ范围内成正比。本发明专利技术方法简便、微量、快速、准确、稳定，本方法灵敏度、试剂稳定性明显优于Ｃａｌｍａｇｉｔｅ法和ＭＴＢ法，适用于血清镁的常规手工分析和生化分析仪分析。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于血清镁比色法测定
血清镁的测定方法有原子吸收分光光度法、酶偶联速率测定法和比色法等。原子吸收分光光度法是镁测定的参考方法，因仪器条件限制难以普及。酶偶联法国外文献有过报导，国内未见应用。基于金属络合剂显色的比色法操作简便，反应迅速，其中的Calmagite法和甲基百里酚蓝法(MTB)被广泛采用。但上述两种比色法的灵敏度、MTB法的试剂及反应液稳定性不甚理想。本专利技术的目的是提供一种使用国内新合成的金属离子络合剂2--(8′-羟基喹啉-5′-磺酸-7′-偶氮)-变色酸(8Q5SAC)进行血清镁测定的方法。本专利技术方法简便、微量、快速、准确、稳定，本方法灵敏度、试剂稳定性明显优于Calmagite法和MTB法，适用于血清镁的常规手工分析和生化分析仪分析。本测定方法的实施原理8Q5SAC在碱性缓冲介质中与血清镁络合呈色，波长541nm处有一主吸收峰。以乙二醇双(α-氨基乙基)醚四乙酸(EGTA)掩蔽血清钙。反应液吸光度与镁浓度在一定范围内成正比。材料与方法一、试剂1、缓冲液每升含甘氨酸0.1mol、NaOH 0.13mol、NaCl 0.2mol，EGTA0.2mmol NaN315mmol。2、显色剂每升含8Q5SAC(南昌大学合成)0.3mmol，聚乙烯吡咯烷酮5g，op乳化剂6ml3、10mmol/L镁标准液4、镁标准应用液(1.0mmol/L)5、应用试剂试剂1、2等量混合。室温密闭遮光保存，稳定期至少两周。二、仪器1、722型分光光度计2、pH计三、方法在测定、标准、空白管中分别加人血清、镁标准应用液(1mmol/L)、水各0.02ml，每管加应用试剂3ml。混匀。静置2分钟。540nm波长，1cm光径，空白管调零比色。计算血清镁(mmol/L)＝(测定A/标准A)×1式中测定A测定管吸光度；标准A标准管吸光度；1镁标准应用液浓度1mmol/L实验结果一、吸收光谱以应用试剂调零，镁反应液的吸收光谱(附图说明图1)在541nm和575nm处有两个吸收峰，541nm为主峰。以水调零，应用试剂的吸光度从480nm-600nm为一上升坡形，541nm处空白吸光度明显低于575nm处吸光度。所以，选择540nm为测试波长。二、缓冲体系及pH的选择分别配制以甘氨酸-NaOH和硼酸盐为缓冲体系的系列pH应用试剂与镁反应。以对应管试剂空白调零，读取各管吸光度，图2。其灵敏度甘氨酸-NaOH缓冲体系在pH11.2时最高，硼酸盐缓冲体系在pH9.8时最高，前者的灵敏度大大高于后者。以pH11.2，终浓度25-75mmol/L的甘氨酸缓冲体系应用试剂测镁，甘氨酸浓度为50mmol/L时灵敏度最佳。选择应用试剂缓冲体系为甘氨酸-NaOH，pH11.2，甘氨酸终浓度为50mmol/L。三、8Q5SAC浓度选择试剂空白吸光度与8Q5SAC浓度成正比，测试灵敏度与8Q5SAC浓度在一定范围内正相关，图3，8Q5SAC浓度达0.15mmol/L以上时，灵敏度不再上升。兼顾空白吸光度和灵敏度，选择应用试剂中8Q5SAC终浓度0.15mmol/L。四、EGTA浓度选择8Q5SAC法测定血清镁的最大干扰源是钙。EGTA在pH11.2的反应介质中对钙的选择性明显大于镁。配制含系列EGTA浓度(50-150umol/L)的应用试剂，观察镁灵敏度和钙掩蔽作用。各浓度管的镁灵敏度基本一致，EGTA浓度达75umol/L，可掩蔽样品钙浓度达8mmol/L。选择EGTA终浓度为100umol/L五、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和OP乳化剂浓度选择聚乙烯吡咯烷酮可防止蛋白质干扰反应，降低空白吸光度，提高测试灵敏度，并改变反应液吸收光谱(吸收峰由523nm、560mm移至541mm和575mm)。经试验聚乙烯吡咯烷酮终浓度为2.5g/L时，反应灵敏度最高。OP乳化剂可防止蛋白质对反应的干扰，降低空白吸光度，提高反应灵敏度。OP乳化剂终浓度为3ml/L时，灵敏度最高。六、干扰试验下列物质含量钠1.2mol/L，钾80mmol/L，钙10mmol/L，高铁离子300umol/L，亚铁离子50umol/L，铜50umol/L，锌50umol/L，血红蛋白10g/L，总胆红素386umol/L，对本法均无有意义的干扰。七，回收试验镁浓度0.86mmol/L的混合血清1ml，分别加入10mmol/L镁标准液50、80、100ul，测得值分别为1.28，1.50，1.66mmol/L。回收率依次为98.8％，97.6％、98.2％，平均回收率98.2％。八、线性试验可接受的线性范围0-3mmol/L。图4。九、重复性试验n x s cv％低值 批内200.86 0.023 2.67批间100.87 0.026 2.99高值 批内201.51 0.029 1.92批间101.53 0.039 2.55十 对照试验26份样品镁浓度0.63-1.86mmol/L本法(X)与Calmagite法(Y，TRACE试剂，批号60535)平行测定，r＝0.996Y^=0.948X^+0.041,]]>t＝1.163，P＞0.2。本法(X)与MTB法(Z，科华试剂，批号960811)平行测定，r＝0.983Z^=1.260X^-0.232,]]>t＝1.082，P＞0.2。三种方法平行测定1mmol/L镁标准液(方法标准液0.05ml，试剂7.5ml混匀5分钟，1cm光径，水调零比色)结果见下表 本法与Calmagite法空白吸光度(A空白)基本一致。灵敏度是Calmagite法的2.5倍，是MTB法的4.3倍。十一、显色时间及稳定性即刻显色，显色稳定时间2分钟至l5小时。十二、正常参考值测定65例正常成人血清镁，x=0.89mmol/L，s＝0.11，x±1.96s为0.67-1.11mmol/L。本专利技术确定的用8Q5SAC进行血清镁比色测定方法，实验结果证明该法简便、微量、快速，准确性、重复性、线性和抗干扰能力等各项指标均达到满意效果。本法完全可以用于血清镁的常规分析。本方法的优点是设计利用8Q5SAC的灵敏特性，研究优化反应条件，使测镁灵敏度明显高于目前常用的MTB法和Calmagite法，分别高4.3倍和2.5倍，从而使得血清镁比色法测试分辨力低，精度较差的问题有较大改变。本方法的另一优点是所用试剂稳定。双试剂可长期贮存，应用试剂的稳定性(可达两周)也优于Calmagite法(4天)和MTB法(5小时)。因此本法不仅能使手工操作更加简便，而且通过适当编排即能运用于具有双试剂功能的生化分析仪，也能方便地运用于单试剂功能的生化分析仪。本方法的再一优点是主要试剂材料8Q5SAC由国内合成，而且方法性能优于依靠进口试剂的Calmagite法。权利要求1.一种比色测定血清镁的方法，本专利技术的特征是以2-(8′-羟基喹啉-5′-磺酸-7′-偶氮)-变色酸(8Q5SAC)作为金属离子络合剂，在碱性缓冲介质中与血清镁络合呈色，以聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和OP乳化剂作抗蛋白干扰剂和反应增色剂，在波长541nm处有一主吸收峰，以乙二醇双(α-氨基乙基)醚四乙酸(EGTA)掩蔽血清钙，反应液吸光度与镁浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种比色测定血清镁的方法，本专利技术的特征是以２－（８′－羟基喹啉－５′－磺酸－７′－偶氮）－变色酸（８Ｑ５ＳＡＣ）作为金属离子络合剂，在碱性缓冲介质中与血清镁络合呈色，以聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）和ＯＰ乳化剂作抗蛋白干扰剂和反应增色剂，在波长５４１ｎｍ处有一主吸收峰，以乙二醇双（α－氨基乙基）醚四乙酸（ＥＧＴＡ）掩蔽血清钙，反应液吸光度与镁浓度在０－３ｍｍｏｌ／Ｌ范围内成正比。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈力平，黄雅娟，周雪，胡康林，田云，
申请(专利权)人：中国人民解放军第一零一医院，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]