本发明专利技术公开一种血清总胆汁酸检测试剂盒及其使用方法，所述试剂盒包括血清样品预处理液、磷酸盐缓冲液、3α-羟基类固醇脱氢酶(3α—HSD)、氧化型辅酶I(NAD+)及丝网印刷电极。所述血清总胆汁酸检测试剂盒采用丝网印刷电极进行电化学检测，通过电化学分析方法间接地实现血清总胆汁酸的快速、准确测定，是一种试剂简单，价格低廉，使用方便，高性价比的血清总胆汁酸检测试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医疗检测技术，主要涉及。
技术介绍
胆汁酸是胆固醇的代谢产物，在肝脏内主要经胆固醇7 α -脱羟酶经典途径的合成，分泌入肝胆管储存于胆囊内，在食物刺激下排入肠道后，经肠肝循环进入肝门静脉被肝细胞重吸收。胆汁酸可促进脂类物质的消化吸收和增加胆固醇的溶解度防止胆石生成。胆汁酸的升高主要与肝胆疾病有关，在其他疾病如妊娠肝内胆汁淤积症(ICP)也有不同程度升高。目前认为血清总胆汁酸水平是唯一可同时反应肝脏分泌，肝脏合成与代谢以及肝细胞损伤三方面的血清学指标。与其他临床生化指标(转氨酶，胆红素等)相比，胆汁酸的测定也更有助于早期肝硬化的诊断，急性肝炎的预后判断以及区分活动性和非活动性慢性肝炎等，具有重要的临床价值。目前，血清总胆酸的测定方法主要包括以下几种:(I)质谱法能准确测定胆汁酸分子量，对胆汁酸进行分型，但胆汁酸结构比较复杂，需要对结果进行繁琐的分析。检测仪器昂贵，操作复杂且需专人操作，样本需要纯化以避免堵塞仪器。且有离子源产生的记忆效应，污染等问题。(2)色谱法能很好地分离并定量分析血清胆汁酸，但是测定血清胆汁酸前需要对样本进行衍生化和水解，使整个检测过程复杂化，增加了检测时间，不适合临床的广泛应用。(3)放射免疫分析法操作简单，但其生物试剂稳定性会受多种因素影响，且存在放射性污染，对环境和工作人员带来的危害是难以预料的。(4)酶循环法已经在临床得到运用，但试剂价格昂贵，容易造成检测仪器污染，影响测定结果，且需要专用的检测仪器，仪器昂贵难以移动。电化学分析方法是仪器分析方法的重要组成部分之一。它是根据溶液中物质的电化学性质及其变化规律，建立在以电位、电导、电流和电量等电学量与被测物质某些量之间的计量关系的基础上，对组分进行定性和定量的仪器分析方法。应用电化学分析方法测定血清总胆汁酸具有如下优点:设备简单可移动性强，操作简便检测迅速，灵敏度高，选择性好。目前，国内外还没有关于电化学分析方法检测血清总胆汁酸的试剂盒及其使用方法的相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术致力于提供一种试剂简单，价格低廉，使用方便，高性价比的血清总胆汁酸检测试剂盒，本专利技术的血清总胆汁酸检测试剂盒，采用电化学分析方法对血清总胆汁酸进行快速准确的测定。本专利技术的血清总胆汁酸检测试剂盒的检测原理为:利用血清样品中的胆汁酸能在3 α -羟基类固醇脱氢酶(3 a -HSD)特异性地催化下与氧化型辅酶I (NAD+)反应生成3_酮类固醇及还原性辅酶I (NADH)，NADH在丝网印刷电极表面被氧化生成NAD+，同时失去两个电子产生电信号；利用电化学仪对NADH所产生的氧化峰电流进行检测，其氧化峰电流与血清中胆汁酸的浓度呈正相关，从而实现对血清总胆汁酸的间接定量分析。一种血清总胆汁酸检测试剂盒，包括血清样品预处理液、磷酸盐缓冲液、3 a -HSD,NAD+及丝网印刷电极。其中，所述丝网印刷电极包括PET基板，PET基板上以碳浆印制工作电极和辅助电极、Ag / AgCl浆印制成参比电极，工作电极、辅助电极和参比电极与相应的电极触点间通过碳浆连接，再在PET基板上除工作电极、辅助电极和参比电极形成的一圆形工作区域外印刷上一层绝缘胶。更优地，所述血清样品预处理液为甲醇。更优地，所述3 a -HSD活性为40U / mL,所述NAD+浓度为IOOmmol / L。更优地，所述磷酸盐缓冲液为0.2mol / L，pH=12.2的磷酸盐缓冲液。其中，所述磷酸盐缓冲液由0.2mol / L磷酸氢二钠溶液和饱和氢氧化钠溶液配制。一种所述的血清总胆汁酸检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤:I)用所述血清样品预处理液除去血清样品中的蛋白； 2)将除去蛋白后的所述血清样品离心，取上清液用氮气吹干，用磷酸盐缓冲液复溶；3)分别取步骤2)得到的溶液、3 a -HSD溶液及NAD+溶液于Ep管中并混匀，在室温下进行酶反应lOmin，得到胆汁酸酶催化反应混合液；4)所述丝网印刷电极与电化学工作站连接，取步骤3)得到的所述胆汁酸酶催化反应混合液滴加在所述电极的工作区域，用示差脉冲伏安法对酶反应产物NADH的氧化峰电流进行测定。本专利技术所述血清总胆汁酸检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤:I)用甲醇除去血清样品中的蛋白；2)将除去蛋白后的所述血清样品离心，取上清液用氮气吹干，用0.2mol /L，pH=12.2的磷酸盐缓冲液复溶，所述甲醇，血清样品与磷酸盐缓冲液的体积比为12: 4: I ；3)分别取步骤2)得到的溶液、40U / mL的3 a -HSD溶液及IOOmmolNAD+溶液于Ep管中并混匀，在室温下进行酶反应lOmin，得到胆汁酸酶催化反应混合液。所述步骤2)得到的溶液，3 a-HSD溶液与NAD+溶液的体积比为10: I: 10 ；4)所述丝网印刷电极与电化学工作站连接，取步骤3)得到的所述胆汁酸酶催化反应混合液滴加在所述电极的工作区域，用示差脉冲伏安法对酶反应产物NADH的氧化峰电流进行测定。本专利技术所述血清总胆汁酸检测试剂盒的使用方法，包括如下具体步骤:I)取100 μ L血清样品于Ep管中，涡旋条件下缓慢滴加入300 μ L甲醇除去血清中的蛋白；2)将除去蛋白后的血清样品离心，取上清液在60°C用氮气吹干，用0.2mol / L，pH=12.2的25 μ L磷酸缓冲液复溶；3)分别取10 μ L步骤2)得到的溶液、I μ L40U / mL的3 a -HSD溶液和10 μ LlOOmmol / L的NAD+溶液涡旋混匀，在室温下进行酶反应lOmin，得到胆汁酸酶催化反应混合液；4)所述丝网印刷电极与电化学仪连接，将步骤3)得到的胆汁酸酶催化反应混合液滴加在所述电极的工作区域，对酶反应产物NADH的氧化峰电流进行测定从而对血清总胆汁酸定量，其参数设置为:低电位0V，高电位+IV，电位增量0.005V、振幅0.1V、脉冲宽度0.05s、脉冲周期0.2s。本专利技术所述血清总胆汁酸检测试剂盒的有益效果如下:I)本专利技术所述血清总胆汁酸检测试剂盒使用丝网印刷电极配合电化学工作站对血清总胆汁酸进行测定，检测仪器操作简单，价格低廉，可移动性强。2)本专利技术使用的丝网印刷电极成本低，具有可批量制作的特点。实现了电极的一次性使用，避免了对固体电极单调沉闷的打磨抛光；另外也避免了重复使用造成实验交叉污染。3)本专利技术所用试剂种类少，用量小，降低了血清总胆汁酸检测的成本，且可大大降低对环境的污染。4)本专利技术所述的试剂盒用于血清总胆汁酸的检测，检测迅速(小于Imin)，具有良好的精密度，较高的灵敏度，较高的准确度，可用于对血清总胆汁酸进行快速准确测定。 5)本专利技术所述的试剂盒可发展为便携式血清总胆汁酸测量装置，为临床肝胆疾病的诊疗提供实时的胆汁酸水平监测。【附图说明】图1为本专利技术丝网印刷电极结构图。图中1、工作电极，2、辅助电极，3、参比电极，4、圆形工作区域，5、PET基板。图2为血清总胆汁酸的示差脉冲伏安曲线图。图中实线为加标血清的示差脉冲伏安曲线，虚线为空白血清的示差脉冲伏安曲线。图3为本专利技术磷酸盐缓冲液pH值影响NADH的氧化峰电流的曲线图。图中?代表加标血清的氧化峰电流，代表空白血清的氧化峰电流，▲是加标血清与空白血清氧化峰电流的差值。图4为本专利技术NAD+本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种血清总胆汁酸检测试剂盒，其特征在于：包括血清样品预处理液、磷酸盐缓冲液、3α?羟基类固醇脱氢酶(3α?HSD)、氧化型辅酶I(NAD+)及丝网印刷电极。
【技术特征摘要】
1.一种血清总胆汁酸检测试剂盒，其特征在于:包括血清样品预处理液、磷酸盐缓冲液、3 α -羟基类固醇脱氢酶(3 a -HSD)、氧化型辅酶I (NAD+)及丝网印刷电极。2.根据权利要求1所述的血清总胆汁酸检测试剂盒，其中，所述丝网印刷电极包括PET基板，PET基板上以碳浆印制工作电极和辅助电极、Ag / AgCl浆印制成参比电极，工作电极、辅助电极和参比电极与相应的电极触点间通过碳浆连接，再在PET基板上除工作电极、辅助电极和参比电极形成的一圆形工作区域外印刷上一层绝缘胶。3.根据权利要求1或2所述的血清总胆汁酸检测试剂盒，其中，所述血清样品预处理液为甲醇。4.根据权利要求1或2所述的血清总胆汁酸检测试剂盒，其中，所述3a -HSD活性为40U / mL,所述 NAD+浓度为 IOOmmol / L。5.根据权利要求1或2所述的血清总胆汁酸检测试剂盒，其中，所述磷酸盐缓冲液为0.2mol / L，pH=12.2的磷酸盐缓冲液。6.根据权利要求5所述的血清总胆汁酸检测试剂盒，其中，所述磷酸盐缓冲液由0.2mol / L磷酸氢二钠溶液和饱和氢氧化钠溶液配制。7.—种如权利要求1一6任意之一项所述的血清总胆汁酸检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)用所述血清样品预处理液除去血清样品中的蛋白； 2)将除去蛋白后的所述血清样品离心，取上清液用氮气吹干，用磷酸盐缓冲液复溶； 3)分别取步骤2)得到的溶液、3a-HSD溶液及NAD+溶液于Ep管中并混匀，在室温下进行酶反应lOmin，得到胆汁酸酶催化反应混合液； 4)所述丝网印刷电极与电化学工作站连接，取步骤3)得到的所述胆汁酸酶催化反应混合液滴加在所述电极的工作区域，用示差脉冲伏安法对酶反应产物NADH的氧化峰电流进行测定。8.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁敏，罗娟，张晓清，朱明松，崔悦，左明，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：
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