一种血清总胆汁酸的测定方法技术

一种血清总胆汁酸的测定方法，其特征在于：毛细管电泳血清样品聚集胆汁酸，进入柱端检测池的胆汁酸在氧化型辅酶Ｉ（ＮＡＤ）＋共存下经３α－类固醇脱氢酶（３α－ＨＳＤ）催化脱氢，同时ＮＡＤ＋被还原为还原型辅酶Ｉ（ＮＡＤＨ）；而生成的ＮＡＤＨ在恒电位作用下被三联吡啶钌（Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋）氧化为ＮＡＤ＋，同时释放出光子被记录，从而按常规定量总胆汁酸。本发明专利技术方法显著降低了贵重酶试剂，化学试剂和生物样本用量，减少废液，显著提高灵敏度，实现不连续的批量临床样品快速测定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种测定血清中总胆汁酸的方法，具体涉及一种采用电化学发光测定 血清中总胆汁酸的分析方法，属于临床生化分析领域。
技术介绍
胆汁酸(bile acid，BA)是内源性胆固醇在肝脏内的主要代谢产物，是胆汁中存 在的一类胆烷酸的总称，以钠盐或钾盐的形式存在，目前认为血清总胆汁酸水平是唯一可 同时反映肝脏分泌，肝脏合成与代谢以及肝细胞损伤三方面的血清学指标。肝脏疾病时肝 细胞受损可引起胆汁酸合成及排泄障碍，肝细胞内胆固醇7 a -羟化酶及12 a _羟化酶活力 降低，胆汁酸的合成明显减少。肝细胞摄取胆汁酸功能障碍，使胆汁酸从血中的清除速率减 慢，导致血中胆汁酸的浓度升高，尿中胆汁酸的排出量可达正常人的10倍以上。胆汁酸的 毒性作用又加重肝细胞损害，使肝功能进一步恶化。体内胆汁酸盐不足，影响脂类和脂溶性 维生素的吸收和代谢，可发生乳糜泻及暗适应障碍等。在淤胆时，小肠和肾脏上皮转运体通 过调整，减少对胆汁酸的吸收，而在尿液中的排泄增加；同时，肝细胞通过核受体调节，使胆 盐转运体改变，同时产生细胞因子，减少肝内胆盐的积蓄，减轻肝损伤。临床发现，总胆汁酸的测定与谷草转氨酶，谷丙转氨酶等生化检查项目有同等的 诊断效率，且体内总胆汁酸在反映肝功能改变上早于其它生化检查的变化，更具有特异性 和灵敏性，是反映肝胆功能的重要指标。目前检测总胆汁酸的方法有气相色谱、高效液相色谱、毛细管电泳(CE)和酶循环 放大法。不管是气相或液相色谱法测定总胆汁酸都需要衍生和水解，较为繁琐，不适合临床 检测。目前有关胆汁酸的CE检测大都采用紫外检测，检测灵敏度较低，使其应用受到限制。 而临床使用的酶循环放大法测定总胆汁酸成本较高，且灵敏度也有待进一步提高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，本专利技术方法是采用毛细管电 泳_酶促电化学发光测定总胆汁酸，本专利技术测定方法可达到快速简便地测定血清中的总胆 汁酸，适合用于临床诊断与监测；且灵敏度高，可实现微量样品的痕量测定分析；同时可实 现酶和试剂的多次重复使用、成本低。本专利技术的目的是这样实现的—种血清总胆汁酸的测定方法，其特征在于毛细管电泳血清样品聚集胆汁酸，进 入柱端检测池的胆汁酸在氧化型辅酶I (NAD) +共存下经3 a -类固醇脱氢酶(3 a -HSD)催 化脱氢，同时NAD+被还原为还原型辅酶I (NADH)；而生成的NADH在恒电位作用下被三联吡 啶钌(Ru(bpy)32+)氧化为NAD+，同时释放出光子被记录，从而按常规定量总胆汁酸。上述检测池为柱端检测池，上述三联吡啶钌(Ru(bpy)32+)的浓度为3 5mmol/ L，上述3 a类固醇脱氢酶(3 a -HSD)活性为150 200U/L，上述氧化型辅酶I (NAD+)存 在于70 75mmol/L pH7. 8 8. 0的磷酸盐缓冲液中，其在所述缓冲液中的浓度为60 3150nmol/L。上述检测池采用三电极工作体系，其中工作电极为直径500 iim的钼圆盘电极，辅 助电极为直径1mm的钼丝对电极，参比电极为直径300iim的Ag/AgCl参比电极(内充饱和 KC1溶液)，检测电压1. 17 1. 18V，光电倍增管高压为-700V。上述血清样品是将血清用水稀释后采用电动进样至毛细管内，其进样电压为 10KV，进样时间为60s。上述毛细管为开口石英毛细管，其内径为25iim，外径为365 iim，总长度50cm，有 效长度为45cm。胆汁酸通过毛细管电泳聚集，所述毛细管电泳的运行缓冲液为含5 lOnmol/L NAD+的4 6mmol/L pH7. 0 7. 2的磷酸盐缓冲液，运行电压15KV，运行时间400s。具体地说上述柱端检测池采用传统的三电极体系工作电极为直径为500iim的钼圆盘电 极，辅助电极为直径为1mm的钼电极，参比电极为直径为300 y m的Ag/AgCl电极(内充饱 和KC1溶液)，通过检测池的定位螺丝将毛细管和工作电极准直，调节毛细管与电极之间的 距离约150 y m。将电化学发光检测池放入发光检测仪的暗盒中，使透光窗正对光电倍增管， Ru(bpy)32+的电化学发光被光电倍增管收集并转换为电信号记录下来。检测池中为70 75mmol/L,pH7. 8 8. 0 的磷酸盐缓冲液，内含 3 5mmol/L 的 Ru(bpy)32+，150 200U/L 的 3 a -HSD，60 150nmol/L的NAD+。检测池内容物每3h更换一次，以减小溶液蒸发和反应 产物对检测的影响。开口石英毛细管内径为25iim，外径为365 iim，总长度50cm，有效长度 为45cm。毛细管电泳的运行缓冲液为含5 10nmol/L的NAD+的4 6mmol/L pH 7. 0 7. 2的磷酸盐缓冲液。每次实验前分别用0. lmol/L NaOH、纯水、运行缓冲液冲洗20min，毛 细管进样端放入运行缓冲液中，打开电化学分析仪和发光分析仪，待发光信号基线稳定后 采用电动进样方式在10KV电压下进样60s，然后施加15KV的电泳高压400s进行分离检测， 光电倍增管负高压为700V。恒电位设为1. 17 1. 18V。实验室恒温25°C。两次进样电泳 间依次用纯水、运行缓冲液冲洗毛细管3min。本专利技术的各种特征如下本专利技术采用已商品化的多参数电化学发光测定分析装置，实施总胆汁酸的测定和 研究。本专利技术使用的酶类3 a -HSD、NAD+，Ru(bpy)32+均已商品化。本专利技术的有益效果是(1)本专利技术显著降低了贵重酶试剂，化学试剂和生物样本用量，减少废液，显著提 高灵敏度，实现不连续的批量临床样品快速测定。(2)本专利技术将CE技术的分离能力和Ru (bpy) 32+电化学发光(ECL)的高灵敏度检测 相结合，以酶促反应和进行胆汁酸的柱后衍生，建立了 CE-ECL定量总胆汁酸的新方法，本 专利技术兼备了 ECL分析高灵敏度和CE分离能力强的特点，具有检测限低、分离速度快、取样体 积小、溶剂消耗少和样品预处理简单等优点，无疑是一种更理想的总胆汁酸测定方法。(3)用电化学发光代替常规的可见光测定，实现微量样品酶促电化学发光分析；(4)酶在三电极体系中可以重复使用多次，克服了常规情况下酶被进样量稀释后 不稳定的弱点，能大大节约酶、辅酶和其它化学试剂的用量，显著降低了实验成本和化学废4液，有利于临床推广；(5)本专利技术无须对样品进行前处理，可以实现直接测定，操作简便；(6)本专利技术试剂种类少，可以进行不连续的批量的临床样品测定；本专利技术可用于 生物样品的总胆汁酸测定，适用于临床肝胆疾病的快速筛查和诊断。附图说明图1为本专利技术使用的多功能发光检测器的暗盒示意中1毛细管、2光电倍增管、3参比电极、4工作电极、5检测池、6辅助电极图2为本专利技术考察检测池中缓冲溶液的pH对ECL强度影响的曲线3为本专利技术考察检测池中缓冲溶液浓度对ECL强度影响的曲线4为本专利技术考察检测池中Ru (bpy) 32+浓度对ECL强度影响的曲线5为本专利技术考察检测电压对ECL强度影响的曲线6为本专利技术考察检测池中3 a -HSD酶活性对ECL强度影响的曲线7为本专利技术考察检测池中NAD+浓度对ECL强度影响的曲线8为本专利技术考察运行缓冲液pH对ECL强度影响的曲线9为本专利技术考察运本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血清总胆汁酸的测定方法，其特征在于：毛细管电泳血清样品聚集胆汁酸，进入柱端检测池的胆汁酸在氧化型辅酶Ｉ（ＮＡＤ↑［＋］）共存下经３α－类固醇脱氢酶（３α－ＨＳＤ）催化脱氢，同时ＮＡＤ↑［＋］被还原为还原型辅酶Ｉ（ＮＡＤＨ）；而生成的ＮＡＤＨ在恒电位作用下被三联吡啶钌（Ｒｕ（ｂｐｙ）↓［３］↑［２＋］）氧化为ＮＡＤ↑［＋］，同时释放出光子被记录，从而按常规定量总胆汁酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：丁敏，邓文平，王箭，张晓清，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]