活性高度磷酸化人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶的制备及其用途制造技术

本发明专利技术提供活性高度磷酸化人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的组合物、医药组合物及制剂，产生及纯化GALNS的方法，及在诊断、防治或治疗疾病及病状，特别包括GALNS酶缺乏所引起或相关的溶酶体储积疾病，例如黏多糖病(Mucopolysaccharidosis)Iva(MPS?IVa或莫奎欧(Morquio)A综合征）的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及细胞及分子生物学及医药
，特别是活性高度磷酸化人类溶酶体硫酸酯酶的制备及其在管理与溶酶体硫酸酯酶缺乏相关的溶酶体储积疾病中的用途。具体的，本专利技术涉及活性高度磷酸化重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的制备及其在管理黏多糖病(Mucopolysaccharidosis) IVa (MPS IVa或莫奎欧A综合征)及与GALNS缺乏相关的其它溶酶体储积疾病中的用途。现有技术溶酶体储积疾病(LSD)由细胞内为溶酶体中细胞废物降解所必需的特定溶酶体酶缺乏所致。此等溶酶体酶的缺乏导致未降解的“储积物质”在溶酶体内累积，由此导致溶酶体膨胀及功能障碍且最终导致细胞及组织损伤。许多溶酶体酶已经鉴别且与其相关疾病关联。一旦缺失酶已经鉴别，治疗即可简化成高效递送替代酶至患者受影响组织的单一问题。一种治疗溶酶体储积疾病的方式为静脉内酶替代疗法(ERT) (Kakki s，ExpertOpin.1nvestig. Drugsll (5) : 675-685，2002)。ERT利用血管结构将酶自单一投药位点运送至大多数组织。一旦所述酶广泛分布，其必须被吸收至细胞中。在溶酶体酶的独特特征中发现摄取至细胞中的基础。溶酶体酶构成单独的一类由处于末端甘露糖残基6-位置的磷酸酯限定的糖蛋白。甘露糖-6-磷酸酯以高亲和力及特异性由可见于大多数细胞表面上的受体结合(Munier-Lehmann 等人,Biochem. Soc. Trans. 24(1) : 133-136, 1996 ；Marnell 等人，J. Cell. Biol. 99 (6) : 1907-1916，1984)。每条多肽链具有2个甘露糖-6-磷酸酯结合位点的甘露糖-6-磷酸酯受体(MPR) (Tong 等人，J. Biol. Chem. 264:7962-7969, 1989)引导酶自血液摄取至组织接着介导细胞内向溶酶体中的运送。大规模产生溶酶体酶涉及在哺乳动物细胞系中的表达。目标在于使重组酶主要分泌至周围生长培养基中以供收集及下游加工。在用于大规模产生溶酶体酶的理想系统中，酶将经高效磷酸化接着主要被引向细胞表面(即，用于分泌)而非主要引向溶酶体。如上所述，磷酸化溶酶体酶的这种分配与正常细胞中发生的情况完全相反。制备用于产生溶酶体酶的细胞系着重于将每摩尔酶的甘露糖-6-磷酸酯含量最大化，但特征在于低比产率。产生含有高含量甘露糖-6-磷酸酯部分的溶酶体酶的体外尝试成败参半(Canfield等人，美国专利第6，537，785号)。体外酶展现高含量甘露糖_6_磷酸酯以及高含量未经修饰的末端甘露糖。甘露糖-6-磷酸酯与甘露糖受体之间对溶酶体酶的竞争使得高剂量酶为达成有效性所必需，且可导致不利于所治疗个体的较大免疫原性。硫酸酯酶构成独特的溶酶体酶亚类。硫酸酯酶使硫酸酯从各种底物，包括例如类固醇、碳水化合物、蛋白聚糖及糖脂裂解。所有已知真核硫酸酯酶都在其催化位点处含有半胱氨酸残基。硫酸酯酶活性需要将此半胱氨酸残基翻译后修饰成Ca-甲酰甘氨酸(FGly)。 半胱氨酸至FGly翻译后酶活化紧接于翻译之后，在硫酸酯酶靶向溶酶体之前，在内质网内在未折叠硫酸酯酶上发生(Dierks 等人，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA94:11963-11968， 1997)。催化此反应的甲酰甘氨酸产生酶是硫酸酯酶修饰因子I (SUMFl)。SUMFl中导致溶酶体硫酸酯酶中FGly形成异常的突变会导致人类的多种硫酸酯酶缺乏症(Multiple Sulfatase Deficiency, MSD)强调此独特翻译后修饰的重要性(Diez-Ruiz等人，Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 6:355-379，2005)。因此，溶酶体硫酸酯酶制品的治疗有效性取决于制品中甘露糖-6-磷酸酯含量及活性酶的存在。因此，本领域需要用于大规模制备治疗有效的活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶以管理由此类溶酶体硫酸酯酶缺乏引起或与之相关的溶酶体储存病症的高效多产系统。
技术实现思路
本专利技术涉及如下发现当内涵体酸化有缺陷的CHO-Kl细胞系衍生物(称为G71) 经工程改造成表现重组人类硫酸酯酶修饰因子I (SUMFl)时，经修饰G71细胞部分通过防止物质流失至制备用细胞系的溶酶体隔室中而产生高产率的活性高度磷酸化重组溶酶体硫酸酯酶。在一实施方式中，本专利技术提供一种END3互补群细胞系，其共表现重组人类SUMFl 与重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)，从而产生高产率的活性高度磷酸化酶。 示例性细胞系为G71、G71S及其衍生物，所述衍生物保留G71的所需性质，即能够产生高产率的活性高度磷酸化重组溶酶体硫酸酯酶。共表现重组人类SUMFl与重组溶酶体硫酸酯酶的END3互补群修饰的CHO-Kl细胞系的应用将尤其适用于制备用于通过酶替代疗法(ERT) 来管理溶酶体储积疾病的活性高度磷酸化溶酶体硫酸酯酶。在第一方面，本专利技术特征在于一种在END3互补群CHO细胞或其衍生物中产生能够达成治疗用途量的活性高度磷酸化重组人类溶酶体硫酸酯酶或其生物活性片段、突变体、 变体或衍生物的新方法。在一宽泛实施方式中，所述方法包含以下步骤(a)培养CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物；(b)制备能够在CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物中表达活性高度磷酸化重组人类溶酶体硫酸酯酶 或其生物活性片段、突变体、变体或衍生物之第一哺乳动物表达载体；(c)制备能够在CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物中表达重组人类硫酸酯酶修饰因子I(SUMFl)或其生物活性片段、突变体、变体或衍生物之第二哺乳动物表达载体；(d)以第一及第二表达载体转染CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物；(e)选择及克隆表达活性高度磷酸化重组人类溶酶体硫酸酯酶或其生物活性片段、突变体、变体或衍生物的CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物之转染物；及(f)最优化用于制备高度磷酸化重组人类溶酶体硫酸酯酶或其生物活性片段、突变体、变体或衍生物的细胞培养加工方法。重组人类溶酶体硫酸酯酶选自下组芳基硫酸酯酶A(ARSA)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、艾杜糖醒酸(iduronate)-2-硫酸酯酶(IDS)、磺酰胺酶(sulfamidase) / 肝素(h印arin)-N-硫酸酯酶(SGSH)、N-乙酰葡糖胺-硫酸酯酶(G6S)及N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)。所述方法涉及以下步骤将编码所有或部分溶酶体硫酸酯酶的cDNA及编码所有或部分人类SUMFl的cDNA转染至CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物中。在一些实施方式中，将分别能够表达编码活性高度磷酸化重组人类溶酶体硫酸酯酶及人类SUMFl的第一及第二表达载体同时转染至CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物中。在一些实施方式中，将第一及第二表达载体依序转染至CHO衍生的END3互补群细胞或其衍生物中。在一些实施方式中，使用编码全长人类溶酶体硫酸酯酶的cDNA，而在其它实施方式中，使用编码其生物活性片段、突变体、变体或衍生物的cDNA。在一些实施方式中，使用编码全长人类 SUMFl的cDNA，而在其它实施方式中，使用编本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.07.22 US 61/366,7141.一种纯化重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的方法，所述GALNS酶包含与SEQ ID NO:4的氨基酸27至522至少95% —致的氨基酸序列，其中所述GALNS酶 (i)具有至少约95%的纯度，如在非还原条件下进行SDS-PAGE时通过考马斯蓝(Coomassie Blue)染色所测定， ( )具有位置53的半胱氨酸残基转化为Ca-甲酰甘氨酸(FGly)的至少约50%转化率7及 (iii)可选地，每条单体蛋白质链具有O. 5至O. 8条双磷酸化寡甘露糖链，且其中至少97%的所述GALNS酶系呈前体形式，如通过SDS-毛细管凝胶电泳(SDS-CGE)所测定，所述测定包含 a)过滤含有由表达人类硫酸酯酶修饰因子I(SUMFl)及所述重组人类GALNS酶的哺乳动物细胞系分泌的所述GALNS酶的培养基，超滤/渗滤所述经过滤的培养基，及木炭过滤所述经超滤/渗滤的培养基； b)步骤a)所述经木炭过滤的经超滤/渗滤培养基装载于捕获柱上，在使所述GALNS酶保留在所述捕获柱上的条件下洗所述捕获柱，及自所述捕获柱洗脱所述GALNS酶； c)可选地，步骤b)中所述捕获柱的洗脱液由过滤器过滤以去除病毒； d)调整步骤b)所述捕获柱的洗脱液或步骤c)的滤液的pH至酸性pH，及过滤所述捕获柱的所述经调整为酸性PH的洗脱液或所述经调整为酸性pH的滤液； e)所述捕获柱的所述经调整为酸性pH的洗脱液或步骤d)所述经调整为酸性pH的Q滤液装载于中间柱上，在使所述GALNS酶保留在所述中间柱上的条件下清洗所述中间柱，及从所述中间柱洗脱所述GALNS酶； f)调整步骤e)中所述中间柱的洗脱液至低PH以使病毒失活；及 g)步骤f)所述低pH病毒失活的洗脱液装载于精制柱(polishingcolumn)上,在使所述GALNS酶保留在所述精制柱上的条件下清洗所述精制柱，及从所述精制柱洗脱所述GALNS 酶。2.如权利要求1所述的方法，其中所述培养基在步骤a)中浓缩约20倍。3.如权利要求1所述的方法，其中步骤a)中的木炭过滤器为ZetaPlus R55活性碳过滤器。4.如权利要求1所述的方法，其中步骤b)中所述的捕获柱为Zn固定金属亲和层析(Zn-1MAC)柱。5.如权利要求4所述的方法,其中所述Zn-1MAC柱为Zn螯合琼脂糖凝胶(Sepharose)FF柱。6.如权利要求1所述的方法，其中进行步骤c)且所述过滤器为MustangQ过滤器。7.如权利要求1所述的方法，其中步骤b)所述捕获柱的洗脱液或步骤c)中所述滤液的pH在步骤d)中调整至约4. 5±0.1。8.如权利要求1所述的方法，其中步骤e)中所述中间柱为阳离子交换柱。9.如权利要求8所述的方法，其中所述阳离子交换柱为FractogelEMD SE HiCap柱。10.如权利要求1所述的方法，其中用于病毒失活的所述酸性pH在步骤f)中调整至约3.5±0· I。11.如权利要求1所述的方法，其中步骤g)中所述精制柱为疏水性相互作用层析(HIC)柱。12.如权利要求11所述的方法，其中所述HIC柱为ToyoPearl丁基650M柱。13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包含 h)使步骤g)中所述精制柱的洗脱液经缓冲液交换至制剂中； i)通过病毒过滤器及DNA过滤器过滤步骤h)所述的经缓冲液交换的制剂来去除任何残余病毒及DNA ;及 j)添加非离子表面活性剂至步骤i)所述的制剂中。14.如权利要求13所述的方法，其中步骤h)中所述的制剂包含20mMNa0Ac/H0Ac、50mMNaH2P04、30mM精氨酸盐酸盐、2%(w/v)山梨糖醇，pH5. 4。15.如权利要求13所述的方法，其中步骤h)所述的制剂中的所述GALNS酶经调整至约3mg/mL。16.如权利要求13所述的方法，其中步骤i)中所述的病毒过滤器为DV20过滤器且步骤i)中所述的DNA过滤器为Mustang Q过滤器。17.如权利要求13所述的方法，其中步骤j)中所述的非离子表面活性剂为聚山梨醇酯20(PS20)，其中PS20在最终形成物中的浓度为O. 01%(w/v)。18.一种纯化重组人类N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)的方法，所述GALNS酶包含与SEQ ID NO:4的氨基酸27至522至少95% —致的氨基酸序列，其中所述GALNS酶 (i)具有至少约95%的纯度，如在非还原条件下进行SDS-PAGE时通过考马斯蓝染色所测定， ( )具有位置53的半胱氨酸残基转化为Ca-甲酰甘氨酸(FGly)的至少约50%转化率7及 (iii)可选地，每条单体蛋白质链具有O. 5至O. 8条双磷酸化寡甘露糖链，且其中至少97%的所述GALNS酶系呈前体形式，如通过SDS-CGE所测定，所述测定包含 a)过滤含有由表达人类硫酸酯酶修饰因子I(SUMFl)及所述重组人类GALNS酶的哺乳动物细胞系分泌的所述GALNS酶的培养基，超滤/渗滤所述经过滤的培养基，从而所述经超滤/渗滤的培养基浓缩约20倍，及木炭过滤所述浓缩20倍的经超滤/渗滤的培养基； b)步骤a)所述经木炭过滤的经20倍超滤/渗滤的培养基装载于Zn螯合琼脂糖凝胶FF捕获柱上，在使所述GALNS酶保留在所述柱上的条件下清洗所述柱，及从所述柱洗脱所述GALNS酶； c)可选地，经过滤器过滤步骤b)中的所述Zn螯合琼脂糖凝胶FF捕获柱的洗脱液以去除病毒； d)调整步骤b)的所述Zn螯合琼脂糖凝胶FF捕获柱的洗脱液或步骤c)的滤液的pH至约pH4. 5±0. 1，且过滤所述经调整为pH4. 5的所述Zn螯合琼脂糖凝胶FF捕获柱的洗脱液或所述滤液； e)所述经调整为pH4.5的所述Zn螯合FF捕获柱的洗脱液或步骤d)的滤液装载于Fractogel EMD SE H1-Cap阳离子交换柱上,在使所述GALNS酶保留在所述柱上的条件下清洗所述柱，且从所述柱洗脱所述GALNS酶； f)调整步骤e)所述的FractogelEMD SE H1-Cap阳离子交换柱的洗脱液的pH至约pH3. 5±0.1以使病毒失活；g)步骤f)所述的PH3.5病毒失活的洗脱液装载于ToyoPearl 丁基650M精制柱上，在使所述GALNS酶保留在所述柱上的条件下清洗所述柱，且从所述柱洗脱所述GALNS酶； h)使步骤g)所述的ToyoPearl丁基650M精制柱的洗脱液经缓冲液交换至包含20mMNa0Ac/H0Ac、50mM NaH2P04、30mM精氨酸盐酸盐、2%(w/v)山梨糖醇(pH5. 4)的制剂中，且调整所述GALNS酶在所述制剂中的浓度至约3mg/mL ； i)通过DV20过滤器及MustangQ过滤器过滤步骤h)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：V·科帕卡，M·C·斐拉德，A·O·奥克哈马菲，K·阿拉亚，
申请(专利权)人：生物马林药物股份有限公司，
类型：
国别省市：