人类肌醇需酶IRE1α是一种同时具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性和核糖核酸内切酶活性的双功能酶。细胞处于内质网应激时，可诱导IRE1α内质网腔的结构域发生二聚化，进而激活胞质的蛋白激酶域（Kinasedomain）和羧基末端具有核糖核酸内切酶活性的RNase结构域，这一过程可以缓解内质网应激压力，同时我们发现IRE1α蛋白激酶域、RNase结构域及全长均可以上调软骨分化相关靶基因ColII/ColX的表达诱导软骨细胞分化，促进骨生长发育和骨质生长，靶向修复受损关节，促进软骨内骨生长和软骨修复，具有预防和治疗关节炎的作用。IRE1α具有促进骨生长发育、修复受损骨关节的独特生物学作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术专利技术涉及ー种新型的促进骨生长发育、靶向骨发育异常的双功能酶IREla (inositol requiring enzyme I a ),此专利技术属于医药卫生领域,可以直接应用于骨外科或创伤修复等临床和基础医学领域。 人类肌醇需酶IREl a由ERNl基因编码、位于内质网(ER)上的跨膜蛋白，是ー种同时具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性和核糖核酸内切酶活性的双功能酶。细胞处于内质网应激(Endoplasmic reticulum stress , ERS)时,可诱导IREl a的内质网腔的结构域发生ニ聚化，激活胞质的蛋白激酶域(Kinase domain),进而发生自身磷酸化作用，进ー步激活特定位点羧基末端具有核糖核酸内切酶活性的RNase结构域，从而剪切ー种重要的转录因子XBPl。这种非经典的mRNA剪接方式会引起未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)的转录过程，该过程可以缓解内质网应激压力。ERS介导的未折叠蛋白反应直接指导和參与ERS状态下内质网中异常蛋白质的降解和再折叠，维持内质网内环境的稳定，实现对细胞的保护。其中IREl a-XBPl是决定细胞最终命运的关键通路，也是促进细胞分化的关键途径。我们首先在软骨细胞分化的不同时相检测了 IREla的转录与表达，同时运用免疫组织化学技术在不同胎龄小鼠骨生长板软骨细胞内检测了 IREla的表达，我们发现IREl a在软骨细胞分化各个时期均有表达。同时，我们构建IREl a的腺病毒载体Ad-IREl a，分别处理微团培养的ATDC5和C3H10T1/2细胞，利用realtime PCR和免疫印迹等研究方法检测发现IREl a在软骨细胞中可以明显上调软骨细胞分化各标志基因Colli、ColX及COMP的表达；而运用RNAi技术抑制IREl a的表达可以显著抑制BMP2诱导的软骨细胞分化，因此，IREla是ー种可以促进软骨细胞分化的双功能酶。这ー专利技术可以直接应用于骨外科或创伤修复等临床和基础医学领域，有助于探索与解析软骨发育新的调控机制、为开发參与软骨生成与修复的生物制剂和药品提供靶分子。
技术介绍
目前，临床使用的大多数药物治疗不能有效促进关节软骨缺损的愈合；自体软骨来源又非常有限，软骨移植手术也相应受到限制。因此，研发促进软骨修复的生物制剂是非常有意义的。我们在前期研究中发现IREl a可以诱导软骨细胞的分化，促进软骨生长和发育。相关
技术介绍
如下 首先，进入互联网美国国家图书馆网站http://www. ncbi. nlm. nih. gov,根据GenBank提供的IREl a基因序列IREla (NM_001433. 3)，用引物设计软件NTI vector设计引物，上游引物加入通W I酶切位点，下游引物加入沿/^III酶切位点，目的基因扩增长度2934bp，构建IREla腺病毒载体Ad-IREl a。同样的方法设计内參GAPDH引物，扩增长度542bp。酶切电泳与测序结果显示构建正确，免疫印迹检测所构建病毒可以正确表达。其次，我们运用不同类型干细胞(C3H10T1/2，ATDC5)的体外微团培养，在软骨细胞分化的不同时期，采用real-time PCR及免疫应迹等方法检测了 IREl a的转录与表达；同时运用免疫组织化学技术在不同胎龄小鼠骨生长板软骨细胞内检测了 IREla的表达，我们发现IREl a在软骨细胞分化的各个时期均有表达，尤其是增殖期和肥大期，并且随着软骨发育的不断成熟，IREl a表达逐渐増加，在新生小鼠软骨发育的肥大期IREl a表达达到峰值。 第三，构建si-IREl a腺病毒载体，与前面构建好的IREl a腺病毒载体Ad-IREl a分别转染干细胞C3H10T1/2和ATDC5，结合干细胞微团培养、小鼠趾骨体外诱导培养等方法，检测IREla与软骨细胞分化的关系，结果显示，IREl a參与诱导软骨细胞的分化，通过上调软骨细胞肥大期标志基因X型胶原(Collagen type X，ColX, Alp)的表达，促进软骨细胞的分化。总之，真核细胞中IREl a具有调控细胞的生长、増殖、分化或者凋亡的能力，是决定细胞最終命运的调节器。我们进一歩通过动物实验证实，IREl a可以促进和诱导软骨细胞的分化，促进骨质增长，修复受损的关节，増加骨关节腔中软骨的密度，从而促进形成关节软骨组织，达到预防和治疗关节炎的作用。
技术实现思路
IREla (inositol-requiring enzyme I a )可以促进软骨细胞的分化与软骨生长发育，促进骨质增长，靶向修复受损的软骨、増加骨关节腔中软骨的密度。我们申请对IREl a上述特定的功能进行专利保护。根据中华人民共和国国家知识产权局发布的“专利审查指南(2010)”第三部分“进入国家阶段的国际申请的审查”部分的规定(P302):如果在申请的专利技术中，某蛋白质已知而其氨基酸序列是未知的，那么只要本领域技术人员在该申请提交时可以容易地确定其氨基酸序列，编码该蛋白质的基因专利技术就不具有创造性。但是，如果该基因具有特定的碱基序列，而且与其他编码所述蛋白质的、具有不同碱基序列的基因相比，具有本领域技术人员预料不到的效果，则该基因的专利技术具有创造性。因此，我们认定我们申请的关于“ー种新型促进骨生长发育、靶向骨发育异常的双功能酶”专利技术专利是完全符合中华人民共和国国家知识产权局各项规定的，恳请国家知识产权局给予批准与支持。权利要求1.人类肌醇需酶IREla (inositol requiring enzyme I a )在制备促进骨生长发育、靶向骨发育异常药物中的用途。2.根据权利要求I所述的用途，其特征在于所述IREla可以明显上调骨生长发育各标志基因II型胶原、X型胶原及碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)的表达、促进软骨细胞的肥大和矿化、明显促进软骨内骨化、软骨修复及骨的生长发育。3.我们需要申请的权利要求如下我们发现的人类肌醇需酶IREla具有促进和诱导软骨细胞分化，促进骨生长发育的这一生物学功能与用途具有创造性和创新性，属于我们的独创性工作，在此申请专利保护。全文摘要人类肌醇需酶IRE1α是一种同时具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性和核糖核酸内切酶活性的双功能酶。细胞处于内质网应激时，可诱导IRE1α内质网腔的结构域发生二聚化，进而激活胞质的蛋白激酶域(Kinasedomain)和羧基末端具有核糖核酸内切酶活性的RNase结构域，这一过程可以缓解内质网应激压力，同时我们发现IRE1α蛋白激酶域、RNase结构域及全长均可以上调软骨分化相关靶基因ColII/ColX的表达诱导软骨细胞分化，促进骨生长发育和骨质生长，靶向修复受损关节，促进软骨内骨生长和软骨修复，具有预防和治疗关节炎的作用。IRE1α具有促进骨生长发育、修复受损骨关节的独特生物学作用。文档编号A61K38/45GK102949711SQ20121030706公开日2013年3月6日 申请日期2012年8月27日 优先权日2012年8月27日专利技术者郭风劲 申请人:郭风劲, 重庆医科大学本文档来自技高网...
【技术保护点】
人类肌醇需酶IRE1α（inositol?requiring?enzyme?1α）在制备促进骨生长发育、靶向骨发育异常药物中的用途。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭风劲，
申请(专利权)人：郭风劲，重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：
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