用于提高在体内的效力的PLP和PEG-rMETase的用途制造技术

本发明专利技术涉及５’磷酸吡哆醛依赖性酶的修饰方法，以延长该酶的血清半衰期，延长宿主体内甲硫氨酸的清除时间，并且降低该酶的免疫原性。优选的被修饰的ＰＬＰ－依赖性酶是甲硫氨酸酶，优选重组的甲硫氨酸酶（ｒＭＥＴａｓｅ）。本发明专利技术还进一步涉及包括经修饰的ＰＬＰ－依赖性酶的组合物及使用其的方法。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于提高在体内的效力的PLP和PEG-rMETase的用途于联邦赞助研究下做出的专利技术权利声明本研究部分由国立癌症研究所资助，项目编号1 R43 CA86166-01。
本专利技术涉及5’磷酸吡哆醛(PLP)依赖性酶的修饰方法，以延长酶的血清半衰期，延长宿主体内甲硫氨酸的清除时间，并且降低酶的免疫原性。优选的被修饰的PLP-依赖性酶是甲硫氨酸酶，优选重组的甲硫氨酸酶(rMETase)。本专利技术还进一步涉及包括经修饰的PLP-依赖性酶的组合物及使用其的方法。
技术介绍
前面的研究已经大量的证明多种人类肿瘤在体外对rMETase敏感。与非肿瘤细胞相比，rMETase对多种癌细胞系的IC50要低好几倍。rMETase诱发的敏感性尤其对乳腺、肾、结肠、肺和前列腺细胞系具有明显的优势。(Tan，Y.等，Protein Expr.Purif.(1997)9：233-245，Tan，Y等，Clin.Cancer Res.(1999)5：2157-2163)。在小鼠的xenograph模型中用不同的肿瘤细胞系的后续评价显示了对rMETase的类似的敏感性。另外，rMETase介导的血浆甲硫氨酸清除导致对几种不同的化疗剂的肿瘤敏感性增强。不幸的是，rMETase的免疫原性和短的血清半衰期限制了该重要的治疗剂的发展。
技术实现思路
以下说明涉及PLP-依赖性酶如rMETase的修饰方法，以延长该酶的血清半衰期，延长宿主体内甲硫氨酸的清除时间，并降低酶的免疫原性。本专利技术还进一步涉及包括经修饰的PLP-依赖性酶的组合物及使用其的方法。甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基戊二酸酯PEG(methoxypolyethyleneglycol succinimidyl glutarate PEG)(MEGC-PEG)用来对rMETase传递新的分子和功能优势。有效的酶血清半衰期和甲硫氨酸的清除时间的显著延长是通过rMETase的PEG化实现的。酶的免疫原性也因PEG化而有利地降低。并-->且也观察到rMETase的PEG化降低了酶对5’磷酸吡哆醛(PLP)的依赖性，PLP是rMETase功能需要的辅助因子。图例的简单说明图1：显示了MEGC-50HS-PEG(甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基戊二酸酯-PEG)的化学结构。图2：显示了原型(naked)和PEG化的rUETase的SDS-PAGE结果。图3：显示了原型和PEG化的rUETase的几个MALDI谱图。图4：是描述小鼠经静脉注射原型和PEG化rMETase后的血浆酶活性的图。图5：是描述小鼠经静脉注射原型和PEG化的rMETase后的血浆甲硫氨酸清除的图。图6：是描述小鼠在没有植入和植入PLP泵时的血浆PLP浓度图。图7：是描述小鼠植入PLP泵并经静脉注射原型和PEG化的rMETase后的血浆甲硫氨酸清除的图。图8：是描述被标明的PEG化的rMETase在有和没有PLP补充的情况下清除的血浆甲硫氨酸水平的比值。原始数据参照图5和图7。本专利技术的其它特点和优势随着以下的详细叙述以及权利要求将会得到明显显示。本专利技术的实施方式蛋白与聚乙二醇(PEG)的偶联已显示可以增加不同治疗性蛋白的血清半衰期并降低免疫原性(Kozlowski，A.和Harris，J.M.，J.Control Release(2001)72：217-224)。PEG-偶联的蛋白显示增加可溶性、降低抗原性、降低对蛋白水解的敏感性、降低肾清除速率。PEG偶联物还显示增加选择性的肿瘤靶向性。FDA已经批准的PEG化的蛋白治疗剂有腺苷脱氨酶、天冬酰胺酶、α-干扰素(IFN)和生长激素拮抗剂(Olson，K.等，(1997)Poly(ethyleneglycol)：Chemistry and Biological Applications(J.M.Harris，S.Zalipsky，eds.)，ACSBooks，Washington，DC，pp.170-181)。治疗丙型肝炎的PEG-α-IFN(Park，C.W.G.和Chuo，M.，(1999)美国专利5,951,974)最近有两种形式获得批准。具有-->顽固性或复发性的成淋巴细胞白血病(ALL)的病人通过PEG-天冬酰胺酶和甲氨喋呤、长春新碱和泼尼松联合用药进行治疗(Aguayo，A等，Cancer(1999)86：1203-1209)。腺苷脱氨酶(ADA)的遗传缺乏产生抑制免疫系统发育的缺陷，使得病人对几乎任何类型的感染都敏感。PEG-ADA显著地加强了这些病人的免疫系统(Pool，R.，Science(1990)248：305；和Hershfield，M.S.，Clin.Immunol.Immunopathol.(1995)76：S228-S232)。除聚乙二醇外，任何的聚亚烷基二醇(polyalkylene glycol)也可以通过本专利技术进行应用。术语聚(亚烷基二醇)是指分子式为HO--[(烷基)O]y--OH的聚合物，其中烷基指C1到C4的直链或者支链烷基，包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基以及异丁基。Y是大于4的整数，典型地在8到500之间，更优选40-500之间。任何PLP-依赖性酶都可以按照描述的方法使用，可以使用的酶的例子包括：胱硫醚γ-裂解酶；胱硫醚γ-合酶；O-乙酰基高丝氨酸O-乙酰基丝氨酸硫化氢解酶；天冬氨酸氨基转移酶；嗜热丙氨酸消旋酶；嗜冷丙氨酸消旋酶；L-甲硫氨酸γ-裂解酶(MGL)；L-胱硫醚β-裂解酶；L-胱硫醚γ-合酶；D-氨基酸转氨酶；D-氨基酸氨基转移酶(D-AAT)；亮氨酸脱氢酶；氨基酸消旋酶；ω氨基酸转氨酶；色氨酸合酶β亚单位样PLP依赖性酶；镍铁氢化酶；O-乙酰基丝氨酸硫化氢解酶；胱硫醚-β合酶；多巴脱羧酶；1-氨基环丙烷-1-羧化酶(carboxylate)(ACC)；L-苏氨酸脱水酶；L-丝氨酸脱水酶和甲硫氨酸酶。PLP依赖性酶的重组形式也可以用此公开的方法。采用本领域技术人员已知的技术，PLP依赖性酶的活性能够通过突变酶的氨基酸序列，或者通过替换，或者通过失活酶的一部分而改变。PLP依赖性酶在以下有介绍：Yoshimura，T.等，Biosci.Biotechnol.Biochem.(1996)2：181-187；Motoshima，H.等，J.Biochem.(Tokyo)(2000)3：349-354；Grabowski，R.等，Trends BiochemSci.(1993)8：297-300；和van Ophem，P.W.等，Biochemistry(1999)4：1323-1331。在优选的实施方案中，重组的甲硫氨酸酶以文中描述的方法使用。跟其它很多细菌多肽和蛋白一样，rMETase可在高等动物中具有免疫原性，这可以限制rMETase的应用，尤其是考虑多剂量应用的时候。抗METase的抗体可以加速rMETase的清除，从而降低其治疗效力。这些抗体还可以通过在酶的活性位点或者其附近结合而降低酶的效能。还可以发生对rMETase的过敏-->性副反应。目前的数据明显的证实PEG化形式酶的降低的免疫原性，这可能与聚合物修饰掩盖了蛋白的抗原位点相关。不管机理如何，酶的修饰显著增强了临床应用中治疗效力的潜能。要往蛋白上偶联PE本文档来自技高网...

【技术保护点】
有效量的聚亚烷基二醇修饰的甲硫氨酸酶在制备用于降低需要其的受治疗者的血清甲硫氨酸水平的药物中的用途。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2003-7-31 60/491,7621.有效量的聚亚烷基二醇修饰的甲硫氨酸酶在制备用于降低需要其的受治疗者的血清甲硫氨酸水平的药物中的用途。2.权利要求1的用途，其中受治疗者患有肿瘤疾病。3.权利要求2的用途，其中该肿瘤疾病选自乳腺癌、肾癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌。4.权利要求1的用途，其中该药物进一步包含有效量的5’-磷酸吡哆醛(PLP)。5.权利要求4的用途，其中PLP与甲硫氨酸酶制剂分开给药。6.权利要求1的用途，其中血清甲硫氨酸水平低于5μM。7.权利要求1的用途，其中该药物配制成给药于受治疗者至少一次。8.权利要求1的用途，其中该药物配制成用来静脉内给药。9.权利要求1的用途，其中该聚亚烷基二醇是聚乙二醇。10.权利要求9的用途，其中该聚乙二醇是甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基戊二酸酯-5000(MEGC-PEG-5000)。11.权利要求9的用途，其中聚亚烷基二醇与甲硫氨酸酶的摩尔比大约是30∶1。12.权利要求9的用途，其中聚亚烷基二醇与甲硫氨酸酶的摩尔比大约是60∶1。13.权利要求9的用途，其中聚亚烷基二醇与甲硫氨酸酶的摩尔比大约是120∶1。14.权利要求1的用途，其中甲硫氨酸酶是重组产生的。15.权利要求1的用途，其中甲硫氨酸酶是L-甲硫氨酸α-脱氨基-γ-甲硫醇裂解酶。16.权利要求1的用途，其中聚亚烷基二醇修饰的甲硫氨酸酶的特征为比未经修饰的甲硫氨酸酶有提高的血清半衰期。17.权利要求16的用途，其中重组甲硫氨酸酶的半衰期通过改变偶联到甲硫氨酸酶上的聚亚烷基二醇的量而调节。18.权利要求17的用途，其中聚亚烷基二醇与甲硫氨酸酶的摩尔比大约是30∶1。-->19.权利要求17的用途，其中聚亚烷基二醇与甲硫氨酸酶的摩尔比大约是60∶1。20.权利要求17的用途，其中聚亚烷基二醇与甲硫氨酸酶的摩尔比大约是120∶1。21.权利要求1的用途，其中血清甲硫氨酸水平的降低敏化受治疗者的肿瘤细胞。22.权利要求21的用途，其中该药物进一步包含化疗剂。23.权利要求22的用途，其中化疗剂选自以下药物：卡铂、顺铂、环磷酰胺、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、丝裂霉素C、米托蒽醌、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、甲氨喋呤、喜树碱、依立替康、托泊替康、博来霉素、多西他赛、多柔比星、依托泊苷、紫杉醇、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、染料木黄酮、曲妥单抗、ZD1839；细胞毒性剂；凋亡诱导剂、细胞周期控制抑制剂、维拉帕米和环孢素A。24.长期降低血清甲硫氨酸水平的方法，包括给药于需要其的受治疗者包括偶联有聚亚烷基二醇的...

【专利技术属性】
技术研发人员：八木繁雄，杨志坚，李树宽，孙兴华，谭玉英，
申请(专利权)人：抗癌公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]