改进的荧光蛋白制造技术

揭示了具有高荧光性和低毒性的荧光蛋白的改进形式。ＭＶＳＫＱＩＬＫＮＴＧＬＱＥＩＭＳＦＫＶＮＬＥＧＶＶＮＮＨＶＦＴＭＥＧＣＧＫＧＮＩＬＦＧＮＱＬＶＱＩＲＶＴＫＧＡＰＬＰＦＡＦＤＩＬＳＰＡＦＱＹＧＮＲＴＦＴＫＹＰＥＤＩＳＤＦＦＩＱＳＦＰＡＧＦＶＹＥＲＴＬＲＹＥＤＧＧＬＶＥＩＲＳＤＩＮＬＩＥＥＭＦＶＹＲＶＥＹＫＧＲＮＦＰＮＤＧＰＶＭＫＫＴＩＴＧＬＱＰＳＦＥＶＶＹＭＮＤＧＶＬＶＧＱＶＩＬＶＹＲＬＮＳＧＫＦＹＳＣＨＭＲＴＬＭＫＳＫＧＶＶＫＤＦＰＥＹＨＦＩＱＨＲＬＥＫＴＹＶＥＤＧＧＦＶＥＱＨＥＴＡＩＡＱＬＴＳＬＧＫＰＬＧＳＬＨＥＷＶ。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及新型“绿色荧光蛋白”及其应用。特别地，本专利技术涉及特殊的GFP及其变体，这种变体是明亮且无毒的。
技术介绍
绿色荧光蛋白(GFP)最初由Chalfie分离自Aequorea Victoria，美国专利5,491,084。Ward和Chalfie在PCT公布WO 95/21191中报道对其氨基酸序列作了修饰以增加其亮度。如美国专利5,625,048和5,777,079所揭示，Tsien提供了这种蛋白质经过改进的形式，它具有不同的光谱特征并可提供各种不同颜色的荧光。此外，对编码这些蛋白质的核苷酸序列做了修饰以使其序列与人类细胞相容。此外，公布于1999年9月30日PCT公布WO 99/49019提供了一些与绿色荧光蛋白有关的序列信息，这些绿色荧光蛋白由分离自Renilla和Ptilocarpus的基因表达。Gurskaya，N.G.等，BMC Biochem(2002)25描述了一种突变体，这种突变体改变了来自珊瑚的荧光蛋白的发射光谱。上述文件证实了蛋白质氨基酸序列中的变化，这种蛋白质在波长短于可提供一定颜色选择和强度范围的荧光波长的照射激发下产生荧光，在此将这些文件全文并入以供参考。荧光蛋白在科学研究和新项目制造(如玩具)中都有广泛应用。由于对荧光的唯一要求是用适当波长照射，并且由于荧光是肉眼可见的，这些蛋白质被证明是方便的标记并有令人鼓舞的意想不到的应用。已经发现荧光蛋白其它的变体有改进的亮度并具有低毒性。这些蛋白质还可被修饰以得到各种颜色的荧光并改变其强度。专利技术概述专利技术涉及组合物和使用荧光蛋白的方法，所述荧光蛋白与附图说明图1B所示的核苷酸序列编码的蛋白质同源。与已知的荧光蛋白相比，示例性的GFP包括保守性取代基和一些可使其在N-末端部分酸性减弱但在C-末端部分酸性增强的取代基。本专利技术涉及与一组变体有关的组合物和方法，所述变体在接近序列一半的N-末端酸性减弱同时在接近序列一半的C-末端酸性增强。本专利技术的蛋白质是无毒的，含有它们的细胞可存活至少4周-3，4或6个月。因此，一方面，本专利技术涉及变体蛋白质本身并涉及使用这些变体的方法。另一方面，本专利技术涉及编码所述变体的重组物质和用这些物质制造所述变体的方法，以及关于这些重组物质本身的其它应用。附图简述图1A显示了推出的在这里称为A/C的本专利技术变体的氨基酸序列。图1B显示了假定分离自R.reniformis的核酸的核苷酸序列，所述核酸编码图1A的氨基酸序列。图2A、2B和2C显示了基于图1B的核苷酸序列的核苷酸序列，它经过修饰以分别与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大肠杆菌(Escherichia coli)和长双歧杆菌(Bifidobacterium bongum)优选使用的密码子一致。图3显示了标示为A/C的本专利技术变体的氨基酸序列与绿色荧光蛋白的氨基酸序列的比较，所述绿色荧光蛋白克隆自R.mulleri。图4A和4B显示了用来在各种肿瘤细胞系中制造所述变体的逆转录病毒载体的示意图。所述载体被用来包装细胞，所得病毒粒子被用来感染肿瘤细胞系。图5A-5C显示了包装细胞系PT67、黑色素瘤细胞系B16F0和前列腺癌细胞系PC3中表达的荧光蛋白的图象。图6A-6D显示了生长自肺癌细胞系H460、前列腺癌细胞系PC3、胰腺癌细胞系CAPAN-1和结肠癌细胞系PKO的肿瘤的图象。图7A和7B显示了编码来自珊瑚的荧光蛋白第289-964位的核苷酸序列。具体实施方案提供了改进的“绿色荧光蛋白”(GFP)和编码它们的重组物质。这样可使用明亮、无毒的标记以监测基因表达、标记各种细胞以及监测如PCT公布WO 98/49336所述的转移的过程，在此将其并入有关参考。所述本专利技术改进的荧光蛋白提供了更敏感的评估这些现象的方法，且对细胞和整个生物无毒。因此，本专利技术的蛋白质在许多领域都有用，这些领域已知使用上述GFP已知形式的方法。一般GFP的制造和重组材料的使用以及所述GFP本身是此领域熟知的，有许多描述这种荧光蛋白先前已知形式的文献。图1A所示的氨基酸序列的蛋白质，这里称为A/C，发射绿色荧光并有上述亮度和无毒特性。然而，如此领域已知，这些“绿色”荧光蛋白可被修饰，这样它们可发出各种颜色的可见光谱的荧光。因此，通过适当修饰图1A所列蛋白质的氨基酸序列，也可得到红色、黄色、蓝色或其它颜色的荧光。此外，通过使所述氨基酸序列做出小的改变所述荧光的亮度可调节。这些修饰的本性描述在有益的描述在，例如，美国专利5,777,079中，在此将其并入以供参考。如上所述，对在A/C序列第66位发现的丝氨酸残基的修饰可被丙氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸或苏氨酸替代以得到具有红色移位光谱(shifted spectra)的蛋白质，与未经修饰的A/C相比，这种光谱通常比较明亮。其它可影响亮度或荧光波长的修饰包括在第67位发生的那些。所述发色团似乎几种在A/C蛋白质第66-68位，它相应于’079专利所述Aequorea野生型GFP蛋白质第65-67位。因此，第66-68位的突变对于蛋白质性质的改进特别重要。因此，本专利技术包括在第66-68位中任一位尤其是在第66位上具有取代基的突变体其它对分子中1-4个氨基酸的修饰也是允许的；很小数量这种类型的突变不足以将A/C的氨基酸序列转变为任何已知的“绿色荧光蛋白”的氨基酸序列，且对所述分子的性质有极小的影响。因此，本专利技术的蛋白质包括与图1A所示的氨基酸序列至少有90％同源，优选有95％同源，最优选有99％同源的荧光蛋白。特别优选的是具有图1A所示氨基酸序列的荧光蛋白及其变体，所示变体在第66-68位，最好在第66位至少有一个氨基酸取代。同样优选的是上述那些来自珊瑚的蛋白质的经过修饰的类似物，如Gurskaya所示，已在上面引用。编码本专利技术荧光蛋白变体的核苷酸序列可被各种细胞表达。适合由重组系统制造蛋白质的表达系统现在通常是真核细胞、原核细胞，如酵母和真菌、高等植物、动物细胞(包括脊椎动物细胞、哺乳动物细胞，尤其是人类细胞)，和各种细胞系。合适的表达系统和载体取决于宿主的本性和所需应用。除了提供合适的表达系统，所示核苷酸序列可被修饰以将其转变为所需宿主优选使用的密码子。因此，图1B所示的核苷酸序列可含有一个或多个图2A、2B和2C所示的修饰以在指出的宿主中表达，这些宿主分别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大肠杆菌(Escherichia coli)和长双歧杆菌(Bifidobacterium bongum)。因此，为在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达的序列可包含1-230个沉默碱基改变；为在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的序列可包含1-94个沉默碱基改变；为在长双歧杆菌(Bifidobacterium bongum)中表达的序列可包含1-21个碱基改变。所有中间数目的碱基改变也包括在本专利技术的范围内。本专利技术的荧光蛋白和编码它们的重组物质可用于广泛应用，如上面提到的PCT公布WO 99/49019中详细列出的那些，在此将其并入以供参考。所述公布描述了许多应用，包括分析、研究、诊断和商业应用。因此，制造本专利技术荧光蛋白的目的可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有图１Ａ的Ａ／Ｃ蛋白质的氨基酸序列的荧光蛋白或一种与所述Ａ／Ｃ蛋白质有至少９０％同源性的荧光蛋白。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：赵明，徐明旭，姜平，杨萌，
申请(专利权)人：抗癌公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]