用于操控糖蛋白的聚糖含量水平的方法技术

本发明专利技术提供了一种用于操控重组蛋白质上的岩藻糖基化聚糖含量的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于操控糖蛋白的聚糖含量水平的方法专利技术背景在由高等真核生物表达的蛋白质上进行包括甲基化、硫酸化、磷酸化、脂质添加和糖基化在内的多种翻译后修饰。糖基化包括糖部分共价附接至特定氨基酸，且为重组蛋白质最常见且最重要的翻译后修饰之一。蛋白质糖基化在包括蛋白质折叠和质量控制、分子运输和分类以及细胞表面受体相互作用在内的多种功能中起作用。已知许多分泌性蛋白质、膜蛋白和靶向泡囊或某些细胞内细胞器的蛋白质都进行糖基化。虽然糖基化可以有许多形式，但N连接的糖基化是最常见的。N连接的糖基化涉及使寡糖加至在蛋白质中的某些识别序列(例如Asn-X-Ser/Thr)中发现的天冬酰胺残基上。N连接的糖蛋白含有由甘露糖、半乳糖、N-乙酰葡糖胺和神经氨酸构成的标准分支结构。重组表达的治疗性抗体的Fc结构域的N连接的糖基化是一种关键的翻译后修饰。典型的治疗性抗体具有复杂的糖型，该糖型具有其中三甘露糖基核心在每个分支上由N-乙酰半乳糖胺(GlcNAc)、半乳糖和N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)残基封端的岩藻糖基化双触角聚糖。其它糖型可以是非岩藻糖基化型，半乳糖基化型，唾液酸化型，具有末端或等分GlcNAc，具有高量甘露糖(5-9个残基)等等。糖基化会影响重组蛋白药物的治疗功效。众所周知Fc糖基化的变异会影响Fc介导的效应功能。例如半乳糖基化和唾液酸化等一些糖型是降低免疫原性所需要的，而例如非岩藻糖基化、二分GlcNAc残基和高量甘露糖聚糖等其它糖型增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。糖基化对决定治疗性抗体的结构和功能来说是重要的。一旦被引入治疗应用后，其决定着结合能力，并常常决定抗体的识别和加工。在半乳糖基化和岩藻糖基化的情况下，其分别决定其影响的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性和ADCC功能。β-半乳糖基化水平与更“成熟”的糖型有关。添加半乳糖为在分泌前在高尔基体中发生的糖基化的最后阶段之一。唾液酸化需要末端半乳糖，唾液酸化可能是一些蛋白质的糖基化中的最后一步。半乳糖还用作半乳糖结合蛋白的配体，且为与碳水化合物水平有关的多种抗原反应的基础。还展示了半乳糖影响溶液中蛋白质的构形。(Furukawa和Sato，(1999)BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)，1473(1)，第54-86页和Houde等人，(2010)MolecularandCellularProteomics，9(8)，第1716-1728页。岩藻糖基化还作为在分泌前蛋白质成熟的一部分在高尔基体中进行。如果蛋白质进行岩藻糖基化，那么其典型地在糖基化通路中的半乳糖基化前发生。然而，岩藻糖基化并非进行半乳糖基化所必需的(Hossler等人，(2009)_Glycobiology，19(9)，第936-949页)。糖基化对治疗性糖蛋白的生物活性、药物动力学、免疫原性、溶解性和体内清除的影响已经使得糖基化的监测和控制成为生物制药的关键参数。因此，操控治疗性蛋白质的聚糖含量水平的方法将是有益的。在制药行业中需要操控和控制重组治疗性糖蛋白的聚糖含量水平，且实现此同时不显著影响细胞生长、存活力和生产率的方法将是适用的。本专利技术提供了一种通过调节细胞培养基中铜和锰的水平和pH值来操控重组蛋白质上的岩藻糖基化聚糖含量的方法。专利技术概要本专利技术提供了一种操控重组蛋白质上的岩藻糖基化聚糖含量的方法，所述方法包括将生物反应器用表达所述重组蛋白质的宿主细胞接种，在无血清的化学成分确定的细胞培养基中培养宿主细胞；其中细胞培养基包括10至100ppb铜和50至1000nM锰，pH7.0；收获由宿主细胞产生的重组蛋白质，其中与在相同细胞培养基中在较低pH下获得的非岩藻糖基化聚糖水平相比，所述重组蛋白质上的非岩藻糖基化聚糖水平有所增加。在一个实施方案中，所述方法进一步包括增加重组蛋白质上的β-半乳糖基化水平。在一个实施方案中，铜浓度为100ppb。在一个实施方案中，锰浓度为1000nM。在一个实施方案中，对岩藻糖基化聚糖含量进行操作以影响重组蛋白质的效应功能。在一个实施方案中，所述方法进一步包括温度变动。在一相关实施方案中，温度变动是从36℃至31℃。在另一相关实施方案中，温度变动是在生长期与生产期之间进行转变时发生。在又一相关实施方案中，温度变动是在生产期期间发生。在一个实施方案中，将表达重组蛋白质的宿主细胞以分批培养、补料分批培养、灌注培养或其组合进行培养。在一相关实施方案中，培养为灌注培养。在另一相关实施方案中，灌注包含连续灌注。在另一相关实施方案中，灌注速率是恒定的。在另一相关实施方案中，灌注以每天小于或等于1.0工作体积的速率进行。在又一相关中，灌注通过交替切向流来实现。在一个实施方案中，生物反应器具有至少500L的容量。在一个实施方案中，生物反应器具有至少500L至2000L的容量。在一个实施方案中，生物反应器具有至少1000L至2000L的容量。在一个实施方案中，对生物反应器用至少0.5×106个细胞/毫升进行接种。在一个实施方案中，无血清的化学成分确定的细胞培养基为灌注细胞培养基。在一个实施方案中，宿主细胞为哺乳动物细胞。在一个实施方案中，宿主细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施方案中，重组蛋白质为糖蛋白。在一个实施方案中，重组蛋白质选自人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组融合蛋白或细胞因子。在一个实施方案中，由宿主细胞产生的重组蛋白质被纯化和配制成药学上可接受的制剂。在一个实施方案中，为一种由本专利技术的方法产生的重组蛋白质。在一相关实施方案中，因此纯化重组蛋白质。在又一相关实施方案中，重组蛋白质被配制成药学上可接受的制剂。图示简单说明图1积分活细胞密度(106个细胞天/毫升)pH6.8550Mn2+10Cu2+(具有+的灰虚线)pH6.8550Mn2+100Cu2+(具有+的灰线)pH6.851000Mn2+10Cu2+(具有空心圆的灰虚线)pH6.8550Mn2+100Cu2+(具有空心圆的灰线)pH7.050Mn2+10Cu2+(具有+的黑虚线)pH7.050Mn2+100Cu2+(具有+的黑线)pH7.01000Mn2+10Cu2+(具有空心圆的黑虚线)pH7.050Mn2+100Cu2+(具有空心圆的黑线)pH值似乎是影响细胞生长的唯一因素。锰和铜的浓度似乎对细胞生长没有影响。图2存活力(％)pH6.8550Mn2+10Cu2+(具有+的灰虚线)pH6.8550Mn2+100Cu2+(具有+的灰线)pH6.851000Mn2+10Cu2+(具有空心圆的灰虚线)pH6.8550Mn2+100Cu2+(具有空心圆的灰线)pH7.050Mn2+10Cu2+(具有+的黑虚线)pH7.050Mn2+100Cu2+(具有+的黑线)pH7.01000Mn2+10Cu2+(具有空心圆的黑虚线)pH7.050Mn2+100Cu2+(具有空心圆的黑线)到第17天，在pH6.85下的培养物与在pH7.0下的培养物相比最终存活力更高。然而，最终存活力超过80％，无论pH值为多少。在测试范围内的铜和锰浓度对存活力没有影响。Fig.3经红细胞压积调整的滴度(g/L)pH6.8550Mn2+10Cu2+(具有+的灰虚线)pH6.8550Mn2+100Cu2+(具有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于操控重组蛋白质上的岩藻糖基化聚糖含量的方法，所述方法包括：用表达所述重组蛋白质的宿主细胞对生物反应器接种；在无血清的化学成分确定的细胞培养基中培养所述宿主细胞；其中所述细胞培养基包括10至100ppb铜和50至1000nM锰，pH 7.0，收获由所述宿主细胞产生的所述重组蛋白质，其中与在相同细胞培养基中在较低pH值下获得的非岩藻糖基化聚糖水平相比，所述重组蛋白质上的非岩藻糖基化聚糖水平有所增加。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.01 US 62/0857591.一种用于操控重组蛋白质上的岩藻糖基化聚糖含量的方法，所述方法包括：用表达所述重组蛋白质的宿主细胞对生物反应器接种；在无血清的化学成分确定的细胞培养基中培养所述宿主细胞；其中所述细胞培养基包括10至100ppb铜和50至1000nM锰，pH7.0，收获由所述宿主细胞产生的所述重组蛋白质，其中与在相同细胞培养基中在较低pH值下获得的非岩藻糖基化聚糖水平相比，所述重组蛋白质上的非岩藻糖基化聚糖水平有所增加。2.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括增加所述重组蛋白质上的β-半乳糖基化水平。3.根据权利要求1所述的方法，其中铜的浓度为100ppb。4.根据权利要求1所述的方法，其中锰的浓度为1000nM。5.根据权利要求1所述的方法，其中对所述岩藻糖基化聚糖含量进行操控以影响所述重组蛋白质的效应功能。6.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括温度变动。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述温度变动是从36℃至31℃。8.根据权利要求6所述的方法，其中在生长期与生产期之间进行转变时发生所述温度变动。9.根据权利要求6所述的方法，其中在所述生产期期间发生所述温度变动。10.根据权利要求1所述的方法，其中将表达所述重组蛋白质的所述宿主细胞以分批培养、补料分批培养、灌注培养或其组合进行培养。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述培养为灌注培养。12.根据权利要求11所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：DR莱斯克，MT特伦塔兰奇，
申请(专利权)人：美国安进公司，
类型：发明
国别省市：美国,US