一种具有抗菌和抗氧化双活性的苦荞活性肽的制备方法技术

本发明专利技术公开一种具有抗菌和抗氧化双活性的苦荞活性肽的制备方法，属生物工程领域。本发明专利技术利用食品工业用丝状真菌为固态发酵菌株，以苦荞为发酵基质制备，通过固态发酵、超声提取、离心收集、膜过滤等步骤得到具有抗菌和抗氧化双活性的苦荞活性肽。本发明专利技术工艺简单、原料来源广泛、成本低、得率高、产品安全无毒、无残留，且制备的活性肽抗菌活性强，同时具有好的自由基清除活性，可应用于食品防腐保鲜、饲料添加剂及化妆品抗氧化等，在天然抗菌和抗氧化方面具有潜在利用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种具有抗菌和抗氧化双活性的苦荞活性肽的制备方法
本专利技术涉及一种具有抗菌和抗氧化双活性的苦荞活性肽的制备方法，属于生物活性肽的制备领域。
技术介绍
食品腐败菌、致病菌引起的食品腐败变质和食品成分的氧化变质可影响食品品质及食品安全。这两种食品变质不仅会造成经济损失，甚至危害公众健康，给食品安全带来巨大压力。如何防治食品微生物变质和氧化变质是食品工业要解决的重要问题。目前通过食品加工或添加防腐剂、抗氧化剂是预防食品微生物变质和食品氧化变质的主要措施。但是加工过程对食品营养的影响、非食品成分的添加，以及化学防腐剂和抗氧化剂对食品感官品质的影响、在食品体系中的使用范围窄、化学添加剂自身毒副作用以及化学添加剂摄入后在体内残留等缺点是不容忽视的。随着人们消费方式的改变和对食品安全及自身健康的关注，追求更天然、更少化学残留和更少加工过程的健康食品是食品工业发展的一个新方向，这就需要更天然、更有效、更安全的生物防腐剂和抗氧化剂来防控食品的微生物及氧化变质。生物活性肽是蛋白中具有一种或多种特定活性如抗氧化、抗微生物、抗高血压等，长度在2~20个氨基酸的序列，因其低毒、高活性的特点，在食品、医药等领域引起广泛关注。抗菌肽是一类具有抗微生物活性的生物活性肽，属于抗生素家族。它们除了对细菌、真菌有抑菌活性以外，有的抗菌肽对肿瘤细胞、病毒等也具有毒性。抗菌肽在体内最终酶解为氨基酸，无残留毒性。抗氧化肽是具有抑制脂质过氧化和清除自由基功能的一类生物活性肽。与传统的化学抗氧化剂相比，抗氧化肽对人体潜在危害更小，因此越来越多的抗氧化肽被发现，特别是蛋白酶解肽。因此，以天然具有抗菌和抗氧化活性的活性肽为基础解决食品变质问题具有重要意义。获得天然活性肽的化学法和酶解法存在程序繁琐、化学试剂残留、费用高等缺点；微生物液态发酵法的培养基组成复杂、发酵产物浓度低、能耗高。固态发酵法则有培养基简单、产率高、能耗低、环境污染较少等优点。目前固态发酵法制备活性肽主要集中在对抗氧化肽的研究，而固态发酵制备抗菌肽的研究甚少。中国专利CN103333937A一种利用枯草芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法采用分批补料深层液体发酵方式，培养基成分复杂、设备投资大、操作工艺繁琐。中国专利CN101381757A公开了抗菌肽的固态发酵制备方法，这种方法前期需要将抗菌肽基因转入真菌并驯化真菌菌种的复杂工艺，且制备抗菌肽的培养基还需加入尿素、钾盐和生物素这些化学物质，培养基成分复杂。我国荞麦资源丰富，是特色粮食作物苦荞的起源中心之一。苦荞是一种粮药兼用的粮食经济作物，苦荞的蛋白质含量约为10～15%，且50%以上是清蛋白和球蛋白。但目前苦荞利用率不高、产品附加值低。以资源丰富的苦荞为原料，固态发酵制备抗菌及抗氧化双活性肽对活性肽的简单、大量制备及苦荞的深加工和高值化利用有重要意义。
技术实现思路
本专利技术提供一种具有抗菌和抗氧化双活性的苦荞活性肽的制备方法，该苦荞活性肽可应用于食品、饲料和化妆品行业中。包括如下步骤：（1）将真菌孢子接种到马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，28～30℃，相对湿度70～90%，培养5～7天后用无菌生理盐水冲洗下真菌孢子，调整孢子悬液浓度为1×106～1×108个/mL，得到真菌孢子悬液；（2）取苦荞粉80～200g、蒸馏水40～100mL置于发酵瓶中，盖上封口膜，121℃灭菌20～30min，即得苦荞固态发酵培养基；（3）将步骤（1）制得的真菌孢子悬液20～50mL接入苦荞固态发酵培养基，搅拌混匀后于28～30℃、相对湿度70～90%下培养2～4天；（4）向苦荞发酵瓶中加入300～800mL蒸馏水，温度10～20℃，功率150～300W超声提取30～60min，置于离心机4℃、10000r/min离心10～20min，收集上清液，在沸水中煮沸5～10min灭酶，10000r/min离心10～20min，上清液即为苦荞固态发酵液；（5）将步骤（4）得到的苦荞固态发酵液用截留分子量为5000Da的滤膜过滤，滤液用截留分子量为1000Da的透析袋透析18～36h即得到具有抗菌和抗氧化双活性的苦荞活性肽。步骤（1）中所采用的真菌为黑曲霉、黄曲霉、总状毛霉中的任意一种。本专利技术与现有技术相比具有以下优点：1、本专利技术提供了一种利用丝状真菌固态发酵苦荞制备活性肽的方法，直接以苦荞和水为固态发酵基质，采用对人无危害的丝状真菌黑曲霉、黄曲霉和总状毛霉作为发酵用真菌进行固态发酵制备活性肽；制备方法工艺设备简单，原料价廉易得，生产周期短，产品得率高，过程无化学物质添加，适合大规模生产活性肽；2、本专利技术制备的活性肽对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有抑制作用，且具有清除自由基的活性，制备的活性肽产品活性好、无残留、无污染、成本低，可直接应用于食品防腐保鲜、饲料及化妆品添加剂等。具体实施方式以下实施例仅用于阐述本专利技术，而本专利技术的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所属
的普通技术人员依据本专利技术公开的内容和各参数所取范围，均可实现本专利技术的目的。实施例1（1）用无菌接种环挑取斜面总状毛霉（CICC40241）孢子接种到马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，29℃，相对湿度85%，培养5天后用无菌生理盐水冲洗下真菌孢子，调整孢子悬液浓度为2×107个/mL，得到总状毛霉孢子悬液；（2）取苦荞粉200g、蒸馏水70mL置于发酵瓶中，盖上封口膜，121℃灭菌20min，即得苦荞固态发酵培养基；（3）将步骤（1）制得的总状毛霉孢子悬液20mL接入苦荞固态发酵培养基，搅拌混匀后于30℃、相对湿度70%下培养2天；（4）向苦荞发酵瓶中加入300mL蒸馏水，温度10℃，功率230W超声提取45min，置于离心机4℃、10000r/min离心15min，收集上清液，在沸水中煮沸5min灭酶，10000r/min离心15min，收集上清液得到苦荞固态发酵液；（5）将步骤（4）得到的苦荞固态发酵液用截留分子量为5000Da的滤膜过滤，滤液用截留分子量为1000Da的透析袋透析18h即得到具有抗菌和抗氧化双活性的苦荞活性肽。本实施例制得的苦荞活性肽得率为15.6%，大肠杆菌抑菌率54%，金黄色葡萄球菌抑菌率72%，羟自由基清除率56%。肽得率检测方法如下：取固态发酵液，加入10vt%的三氯乙酸，涡漩震荡后静置20min，10000r/min离心10min，取1mL上清液，加入5mL碱性铜溶液，混匀，室温放置10min，加入0.5mL福林-酚试剂并迅速摇匀，30℃水浴孵育30min后测定650nm处吸光值。以牛血清蛋白为标准品制作标准曲线，从标准曲线求出可溶性肽含量。按如下公式计算肽得率：肽得率（%）=发酵液中多肽含量/固态发酵培养基中苦荞蛋白含量×100%细菌抑制率检测方法如下：将100μL经0.22μm水系微孔滤膜过滤的苦荞固态发酵液加入96孔酶标板中，再加入等体积1×106CFU/mL的菌悬液作为试验组；以100μL无菌生理盐水代替等体积苦荞固态发酵液作为对照组；用100μL无菌生理盐水代替等体积的菌悬液用于扣除样品颜色；37℃培养12h后用酶标仪测定620nm下吸光值；按如下公式计算发酵产物液的抑菌率：抑菌率（%）=[对照组OD值-（试验组OD值-样品颜色OD值）]/对照组OD值×100%羟自由基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有抗菌和抗氧化双活性的苦荞活性肽的制备方法，包括如下步骤：（1）真菌孢子悬液制备；（2）苦荞固态发酵培养基制备；（3）固态发酵；（4）苦荞固态发酵液制备；（5）苦荞活性肽制备。

【技术特征摘要】
1.一种具有抗菌和抗氧化双活性的苦荞活性肽的制备方法，包括如下步骤：（1）真菌孢子悬液制备；（2）苦荞固态发酵培养基制备；（3）固态发酵；（4）苦荞固态发酵液制备；（5）苦荞活性肽制备。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）的具体步骤如下：将真菌孢子接种到马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，28～30℃，相对湿度70～90%，培养5～7天后用无菌生理盐水冲洗下真菌孢子，调整孢子悬液浓度为1×106～1×108个/mL，得到真菌孢子悬液。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所采用的真菌为黑曲霉、黄曲霉、总状毛霉中的任意一种。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）的具体步骤如下：取苦荞粉80～200g、蒸馏水40～100mL置于发酵瓶中，盖上封口膜，121℃灭菌20～30min。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）的具体步骤如下：将步骤（1）制得的真...

【专利技术属性】
技术研发人员：李莉蓉，尚东亮，陈翠红，钟严，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53