一种富含黄酮类化合物的活性多糖及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种富含黄酮类化合物的活性多糖及其制备方法，属于天然产物制备的技术领域。本发明专利技术采用定点突变的方式获得内切葡聚糖酶和外切纤维素酶的突变体，并进行复配，提高了复合酶水解花生壳的活性，采用微波辅助酶解与提取的方式，从花生壳中同步获取活性多糖与黄酮类化合物，得到富含黄酮类化合物的活性多糖。本发明专利技术采用的复合酶及制备工艺不仅能够高效制备花生壳活性多糖，并且实现了同步制取花生壳黄酮类化合物与活性多糖的效果，所得富含黄酮类化合物的活性多糖中有效成分高，且具有显著的阳离子交换能力、抗氧化活性和抑菌性，能够有效延长食品货架期，具有抗炎，抗癌，整理肠道、预防肠道疾病，提高人体免疫力，清除外源有害物质等多种生理功能。

Active polysaccharide rich in flavone compound and preparation method thereof

The invention discloses an active polysaccharide rich in flavonoids and a preparation method thereof, belonging to the technical field of the preparation of natural products. The invention adopts the way of obtaining the mutant endoglucanase and cellobiohydrolase mutants, and improve the compound enzymatic hydrolysis of peanut shell activity by microwave assisted enzymolysis and extraction method, the synchronization acquisition activity of polysaccharides and flavonoids from peanut shell, active polysaccharide rich flavonoids the. The invention adopts the compound enzyme and its preparation process can not only efficient preparation of peanut shell active polysaccharide, and achieve the effect of simultaneous preparation of peanut shell flavonoids and polysaccharides, the flavonoid rich active ingredients in polysaccharide, and has significant cation exchange capacity, antioxidant activity and antibacterial that could effectively prolong the shelf life of food, anti-inflammatory, anti-cancer, finishing intestine, prevention of intestinal diseases, improve human immunity, removing exogenous harmful substances and other physiological functions.

【技术实现步骤摘要】
一种富含黄酮类化合物的活性多糖及其制备方法
本专利技术涉及一种富含黄酮类化合物的活性多糖及其制备方法，属于天然产物制备的

技术介绍
多糖是生命有机体的能量贮藏物质，大量存在于植物和微生物细胞壁中，是由醛糖或酮糖通过糖甙键连接起来组成的高分子聚合物，具有毒性小、安全性高、功能广泛的特点，与维持生命所必需的多种功能有关。20世纪60年代真菌多糖被科学家初次发现存在抗癌效果几十年来的研究发展中，人们逐渐认识到多糖作为纯夭然的生物活性调节剂，成为生物有机体核酸和蛋白质之后又一种值得深入探讨的重要信息物质。目前多糖的研究已成为一种热点，从生物体中己提取出的菌类多糖、藻类多糖、植物多糖、花粉多糖等已达数百种，其中的一些多糖具有多种生物活性，如，延缓衰老、抗氧化、抑菌、增强免疫力、抗肿瘤、降血脂、降血糖、预防肥胖、通便、清除外源有害物质等作用。这些具有生物学功能的多糖又被称为“生物应答效应物”或活性多糖，它们在保健品、食品添加剂以及新型药用资源等方面的应用将具有重要的研究意义。目前，植物中活性多糖的获取通常以农产品加工废弃物为原料，采用化学法、机械物理法、酶法、膜分离法和微生物发酵法除去原料中的水分、脂肪、淀粉和蛋白质等物质而制得，所得组分主要含有半乳甘露聚糖、葡聚糖等多糖成分。黄酮类化合物广泛分布于自然界几乎所有植物中，是植物次生代谢物中最大的一类多酚类物质，具有多种生物活性，如预防与治疗心血管疾病、抑菌、抗炎、抗氧化、抗辐射、抗肿瘤、护肝、抗过敏、缓解更年期症状、降低癌症突发概率等。正是因其所具备的多种调节人体生理功能和治疗人类疾病的作用而使黄酮类物质成为目前高端功能性营养化学品的代表，产品利润、市场空间远高于一般的食品或健康食品。目前，通常采用化学法合成、植物提取以及运用微生物生物合成等方式获取黄酮类物质。花生是我国大量栽培、食用广泛的一种经济作物，在花生加工利用过程中，每年约产生500多万吨的花生壳废弃物，除少部分加工成为粗饲料和可食用菌的培养基外，多数花生壳作为燃料或成为垃圾，而花生壳中约有65.7%-79.3%的粗纤维素、10.1%的半纤维素以及其他一些活性成分并未得到有效的开发利用，资源浪费严重。因此，运用生物学手段结合农产品加工技术将花生壳中的纤维素进行改性处理，获得非淀粉多糖，并将其与其他活性成分同步提取出来应用于功能食品中，不仅为花生壳资源的高值化利用提供生产依据，而且所得产品绿色安全，符合当前“环境与发展”的社会理念与形势，契合人们的消费需求，具有重要的应用与经济价值。然而，天然的植物生物质具有复杂的结构和组成，单一的酶不能够对其进行彻底和高效的降解，因此需要采用复合酶降解花生壳中的纤维素而获得非淀粉多糖。研究人员通过考察葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶按不同比例组合进行分解天然纤维素时，发现各酶组分单独作用时效果极差，但当它们协同作用时却表现出很强的分解活性，能够高效降解植物生物质。虽然研究人员已利用商业化纤维素酶的水解作用从花生壳中获取多糖，但加工过程中尚存在酶制剂用量大、水解能力弱、酶解时间长的问题，这是由于不同来源的纤维素酶，其组分不同，各种酶的含量、比例、结构以及活性都存在较大的差异。因此，选择适合于花生壳降解的纤维素酶是高效制备活性多糖的关键。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种能够高效降解花生壳的复合酶，该复合酶由内切葡聚糖酶突变体和外切纤维素酶突变体组成，所述突变是对氨基酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.3所示的来源于里氏木霉的内切葡聚糖酶1EGI和外切纤维素酶1CEL内部氨基酸进行定点突变，从而提高了两种突变体所组成的复合酶水解花生壳的活性。所述突变是将内切葡聚糖酶1EGI第104位的丝氨酸突变为丙氨酸，得到突变体1EGIS104A；将外切纤维素酶1CEL第313位的谷氨酰胺突变为丙氨酸，得到突变体1CELQ313A。在本专利技术的一种实施方式中，所述内切葡聚糖酶突变体1EGIS104A、外切纤维素酶突变体1CELQ313A的氨基酸序列分别如SEQIDNO:2、SEQIDNO:4所示。本专利技术的第二个目的是提供一种提高内切葡聚糖酶1EGI和外切纤维素酶1CEL水解花生壳活性的方法，是将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的内切葡聚糖酶蛋白质分子内部第104位的丝氨酸突变为丙氨酸，将氨基酸序列如SEQIDNO.3所示的外切纤维素酶蛋白质分子内部第313位谷氨酰胺突变为丙氨酸。关于突变体命名：以“酶分子亲本氨基酸位点取代后氨基酸”表示突变体，比如1EGIS104A，是指在内切葡聚糖酶亲本氨基酸序列的基础上将第104位的氨基酸S（丝氨酸，Ser）突变为氨基酸A（丙氨酸，Ala）。本专利技术中，以SEQIDNO.1所示的序列为内切葡聚糖酶亲本序列，以SEQIDNO.2所示的序列为外切纤维素酶亲本序列。本专利技术的第三个目的是提供一种富含黄酮类化合物的活性多糖的制备方法，包括如下制备步骤：（1）花生壳经清洗、烘干、超微粉碎后与水混合，添加由内切葡聚糖酶突变体和外切纤维素酶突变体组成的复合酶，微波辅助酶解；（2）微波辅助同步提取步骤（1）所得混合物中的水溶性多糖和黄酮类化合物；（3）真空抽滤步骤（2）所得混合物，保留抽滤液，并经真空旋转蒸发得到浓缩液，浓缩液冷却后，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12h，离心收集沉淀，同时保留上清液；（4）步骤（3）所得沉淀加水复溶，离心收集上清液，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12h，离心收集沉淀，经真空干燥得到活性多糖；（5）步骤（3）所得上清液经真空旋转蒸发除去乙醇，选择截留分子量为20kDa的超滤膜进行超滤，保留透过液，所得透过液溶解步骤（4）所得活性多糖，该混合物经冷冻干燥获得富含黄酮类化合物的活性多糖。所述复合酶由内切葡聚糖酶突变体1EGIS104A和外切纤维素酶突变体1CELQ313A按比例为5:3~3:1组成。所述微波辅助酶解的条件为：按料液比1:10~1:50混合粉碎的花生壳与水，添加0.5~2.5g复合酶，50℃下微波辅助酶解10-30min。所述微波辅助同步提取的条件为：微波辅助提取温度60~80℃，微波辅助提取时间8~15min。本专利技术还要求保护所述富含黄酮类化合物的活性多糖，或者利用生产富含黄酮类化合物的活性多糖的方法生产得到的富含黄酮类化合物的活性多糖在食品、农业或制备药物方面的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术通过定点突变的方式，分别将内切葡糖酶和外切纤维素酶底物结合口袋中的氨基酸进行突变，提高了二者对花生壳的水解活性及协同作用于花生壳的效果；并通过复配两种酶蛋白的突变体实现高效制备花生壳活性多糖，活性多糖得率达到92%，在同等条件下，比野生型酶蛋白酶解花生壳后的多糖得率提高了49%，比商业纤维素酶制剂酶解后的多糖得率提高了23.6%。本专利技术使用的突变体1EGIS104A和1CELQ313A的水解活性及协同性能都得到了提高，为运用该复合酶加工处理花生壳提供了技术平台，也为其在生物质加工业中的应用奠定了基础。本专利技术的另一个有益效果是采用微波辅助复合酶酶解及提取的工艺方法，实现了高效同步制备活性多糖和黄酮类化合物的目的，并采用乙醇沉淀结合超滤分离的方法获得了富含黄酮类化合物的活性多糖，有效组分含量高，所得本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种富含黄酮类化合物的活性多糖的制备方法，包括如下步骤：（1）花生壳经清洗、烘干、超微粉碎后与水混合，添加由内切葡聚糖酶突变体和外切纤维素酶突变体组成的复合酶，微波辅助酶解；（2）微波辅助同步提取步骤（1）所得混合物中的水溶性多糖和黄酮类化合物；（3）真空抽滤步骤（2）所得混合物，保留抽滤液，并经真空旋转蒸发得到浓缩液，浓缩液冷却后，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12 h，离心收集沉淀，同时保留上清液；（4）步骤（3）所得沉淀加水复溶，离心收集上清液，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12 h，离心收集沉淀，经真空干燥得到活性多糖；（5）步骤（3）所得上清液经真空旋转蒸发除去乙醇，选择截留分子量为20 kDa的超滤膜进行超滤，保留透过液，所得透过液溶解步骤（4）所得活性多糖，该混合物经冷冻干燥获得富含黄酮类化合物的活性多糖。

【技术特征摘要】
1.一种富含黄酮类化合物的活性多糖的制备方法，包括如下步骤：（1）花生壳经清洗、烘干、超微粉碎后与水混合，添加由内切葡聚糖酶突变体和外切纤维素酶突变体组成的复合酶，微波辅助酶解；（2）微波辅助同步提取步骤（1）所得混合物中的水溶性多糖和黄酮类化合物；（3）真空抽滤步骤（2）所得混合物，保留抽滤液，并经真空旋转蒸发得到浓缩液，浓缩液冷却后，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12h，离心收集沉淀，同时保留上清液；（4）步骤（3）所得沉淀加水复溶，离心收集上清液，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12h，离心收集沉淀，经真空干燥得到活性多糖；（5）步骤（3）所得上清液经真空旋转蒸发除去乙醇，选择截留分子量为20kDa的超滤膜进行超滤，保留透过液，所得透过液溶解步骤（4）所得活性多糖，该混合物经冷冻干燥获得富含黄酮类化合物的活性多糖。2.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕洁，孙杰，于丽娜，张初署，王明清，徐同城，杨伟强，张建成，
申请(专利权)人：山东省花生研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37