本发明专利技术涉及基因工程领域，具体地，本发明专利技术涉及一种具有抗肿瘤活性的新型真菌免疫调节蛋白FIP-NHA及其基因。根据本发明专利技术的真菌免疫调节蛋白FIP-NHA，其具有SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列，编码该真菌免疫调节蛋白的基因fip-nha，其具有如SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。本发明专利技术的真菌免疫调节蛋白FIP-NHA具有以下性质：对脾淋巴细胞具有催分裂作用，增加细胞介素2的合成，对三种肿瘤细胞包括肝癌细胞HepG2、胃癌细胞MGC823和白血病细胞HL60均具有明显的抑制增殖作用，因此作为一种新型抗肿瘤生物制剂，可广泛用于保健品及生物医药领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体地，涉及一种具有抗肿瘤活性的新型真菌免疫调节蛋白FIP-NHA及其基因。
技术介绍
真菌免疫调节蛋白(FIPs)是近年来从一些高等担子菌(蘑菇类)子实体中提取得到的一类小分子蛋白质，具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、降低胆固醇和抑制肌体自体免疫等多种生物学活性，因而Fib具有重要的保健、医学、药学价值。它与传统的免疫调节蛋白植物凝集素相似，却具有其自身明显的特点和优势，具体表现为以下几个方面 1)凝集素分子量一般较大，为20-100kD，而Fib分子量较小，为13kD左右；幻单糖及二糖都不减弱Fib的血凝集和免疫调节活性，而典型的凝集素会受到单糖或者二糖的抑制；3) FIPs N端10个氨基酸的α螺旋对于诱导免疫活性十分重要，而此结构在一些凝集素中并不存在。目前国际上已报道从赤灵芝(Ganoderma lucidum)，紫灵芝 (Ganodermajaponcium),松杉灵芝(Ganoderma tsugae),小抱灵芝(Ganoderma microsporum)，金针 (Flammulina velutipes)禾口草燕(Volvariella volvacea)分离纯化了 6种FII3S蛋白，分别命名为LZ-8、Gja、Gts、Gmi、Fve、Vvo和Vvl。6种FII3S蛋白由110 114个氨基酸组成，没有His、Cys和Met，但是富含Asp和Val。其N端的氨基酸均为乙酰化阻断氨基酸，分子量约为12 13kD。该类蛋白与人类及鼠类的免疫球蛋白重链可变区的保守部分有较高的同源性。不同的Fib之间具有较高的同源性，约为57% 100%。天然的真菌免疫调节蛋白都是由两个相同的亚基组成的同源二聚体。N端大约13 个氨基酸形成的α螺旋对真菌免疫调节蛋白二聚化的形成以及有效行使其免疫调节功能十分必要。近年来，随着真菌免疫调节蛋白功能的发现以及人们对健康需求的增强，对免疫调节蛋白的研究和利用提出了更高的要求，而真菌免疫调节蛋白作为一类新型免疫调节蛋白，具有很大的潜在应用价值。基于已知的Fib蛋白又很少，人们对它的生物学特性、免疫调节功能和分子生物学研究有浓厚的兴趣，尤其是随着分子生物学和生物工程技术的迅速发展，利用工程菌株的培养获得大量重组免疫调节蛋白深入开展对真菌免疫调节蛋白的结构、功能和工程菌高效表达的研究具有重要的意义和应用价值，真菌免疫调节蛋白的开发利用具有广阔前景。临床与医药应用均具有一定的剂量要求，实验过程中发现不同的FIP家族成员在促发免疫反应过程中存在剂量效应，比如在激活人外周血淋巴细胞增殖实验中，FlP-fve的有效浓度为100 μ g/ml,FIP-WO的有效浓度仅为5 μ g/ml，而LZ-8促进鼠脾细胞增殖的最佳浓度是3. 13μ g/ml。开发和应用此类药品，必须获得相当数量的蛋白质纯品，然而蘑菇含有大量多糖及其它复杂成分，从蘑菇提取天然Fib难度大又量少，从每千克蘑菇只能提取毫克级蛋白，因此蘑菇提取蛋白成本高，耗时，费力，高消费，量少。1997年HSU等从3kg草菇子实体中提纯FIP-vvo，经不同纯化步骤最终所获得的蛋白质仅Mmg。因此获得高产稳定的重组表达Fib蛋白势在必得。本专利技术选取新的思路，利用生物信息学方法得到一种新的真菌免疫调节蛋白，并且利用基因工程的方法得到纯品FIP-NPA蛋白，对其进行一系列免疫学功能鉴定和抗肿瘤等免疫学活性分析。目前世界上报道的Fib蛋白只有六种，并且全部是从蘑菇中得到的， 这样本专利技术既丰富了 FPs家族的种类，避免了蘑菇蛋白提取的种种缺陷，又满足了临床研究的需求和产业化的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供来源于菌株Nectria haematococca mpVI 77-13-4 (其ATCC 保藏号为MYA-4622)的真菌免疫调节蛋白FIP-NHA。本专利技术的再一目的是提供上述真菌免疫调节蛋白FIP-NHA的基因。本专利技术的再一目的是提供包含上述真菌免疫调节蛋白FIP-NHA的重组载体。本专利技术的再一目的是提供包含上述真菌免疫调节蛋白FIP-NHA的重组菌株。本专利技术的再一目的是提供一种制备真菌免疫调节蛋白FIP-NHA的方法。本专利技术的再一目的是提供上述含有上述真菌免疫调节蛋白FIP-NHA的抗肿瘤药物。本专利技术首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种快速简便获取适合于在保健品和医药中应用的新型真菌免疫调节蛋白FIP-NHA。本专利技术人通过生物信息学方法筛选到一种来源真菌的免疫调节蛋白FIP-NHA，其适合于在保健品和医药中使用。从上述菌株中获得了一种真菌免疫调节蛋白FIP-NHA，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 MATTNDSAVL FYIVASQKKL SFDYTPNWGR GSPNSYIDNL TFPRVLTNKPYKYRVVKAGQ DLGVRDSYSV QSDGSQKVNF LEYNAGRGIA DTQTIQVYVVDPDNGNQYLV AQffK该真菌免疫调节蛋白FIP-NHA全长114个氨基酸，理论分子量为12. 837kDa本专利技术还提供并合成了编码上述真菌免疫调节蛋白FIP-NHA的基因。该全基因序列如SEQ ID NO. 2所示GCTACTACCAACGATTCCGCCGTCTTGTTCTACATTGTCGCATCTCAGAAAAAATTGTCCTTTGACTAT ACTCCTAACTGGGGAAGAGGTTCACCAAACAGTTACATTGATAATTTGACCTTTCCAAGAGTTCTTACTAAC AAGCCTTACAAATATAGAGTTGTCAAGGCTGGTCAAGATTTGGGAGTTAGAGACTCTTACTCCGTCCAATCT GATGGATCCCAGAAAGTCAACTTCCTTGAATATAATGCTGGTAGAGGAATTGCCGACACTCAGACAATCCAA GTCTATGTTGTTGACCCAGATAACGGAAACCAATACCTTGTCGCCCAATGGAAGTAA本专利技术通过一对引物FIP-nha-F(EcoRI 5，-GAA TTC GCT ACT ACC AAC G-3，)和 FIP-nha-R(XhoI 5，-CTC GAG TTA CTT CCA TTG GGC GAC-3，)，用基因合成的方法克隆了这一真菌免疫调节蛋白FIP-NHA，DNA全序列分析结果表明，FIP-NHA全长342bp，其cDNA序列如SEQ ID NO. 2所示。该蛋白属于一种新型的真菌免疫调节蛋白。将其cDNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现，该基因与来源于小孢灵芝(Ganodermamicrosporum) 真菌免疫调节蛋白GMI的序列一致性最高为67%，与来源于赤灵芝(Ganoderma lucidum) LZ-8 为 66 % ；松杉灵芝(Ganoderma tsugae)同源性为 66 % ；紫灵芝(Ganoderma japoncium)FlP-gja 64%, (Volvariellavolvacea)FIP-vvo63%;金针 (Flammulina Velutipes)FIP-f本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种新型真菌免疫调节蛋白ＦＩＰ－ＮＨＡ，其特征在于，其氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤＮＯ．１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姚斌，赵珩，李淑英，罗会颖，孟昆，杨培龙，王亚茹，黄火清，石鹏君，袁铁铮，柏映国，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：11
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