本发明专利技术公开了一种荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法及应用，包括：孢子悬液的制备；荷叶总生物碱的制备；荷叶总生物碱抑菌效果的测定；荷叶总生物碱最低杀菌浓度的测定；荷叶总生物碱最低抑菌浓度的测定。本发明专利技术首次明确荷叶总生物碱对植物病原真菌具有明显的抑制活性。尤其对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性最强，最低抑菌浓度和最低杀菌浓度均为160μg/mL；由于我国荷叶资源丰富,从荷叶中提取生物碱类活性物质，成本低廉、无毒无害；荷叶总生物碱用于防治植物病害，可作为一种潜在的生物农药，具有广阔的开发应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，尤其涉及一种荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制 活性方法及应用。
技术介绍
荷叶为睡莲科多年生水生草本植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn)的叶片，又名 莲叶，藕叶。我国荷叶资源丰富，以长江、黄河和珠江等三大流域分布最广。传统医学认为， 荷叶味苦、平，归肝、脾、胃经，具有清暑利湿、升发清阳、清心去热、止血利水的活性。据《本 草纲目》记载"荷叶服之，令人瘦劣"、"生发元气，稗助脾胃，涩精浊，散淤血，消肿痛，发痘 疮"。在2003年3月中华人民共和国卫生部的卫监发(2002)第51号文件中，荷叶被列入第2批 "既是食品又是药品"的名单之中。目前，荷叶的临床应用较多的是以复方的形式用于减肥 降脂。此外，荷叶金银花口香糖通过在口香糖配料中加入适量对口腔有保健作用的荷叶抑 菌成分，以增加口香糖的保健功能。荷叶化学成分复杂，除含有植物所共有的碳水化合物、 脂质、蛋白质、无机盐和水等成分外，还含有生物碱、黄酮等多种生物活性成分。干荷叶中总 生物碱含量约为1.0%，主要为异喹啉类和阿朴啡类，并多以去氢和甲基化两种形态存在。 研究发现，荷叶中生物碱类物质能干扰微生物蛋白质的代谢，抑制纺锤体微管蛋白聚合，同 时还能抑制RNA聚合酶的活力，中断细胞膜脂质的合成和氨基酸在细胞膜上的转运，使微生 物的有丝分裂停止于中期，因此具有良好的抗菌作用。如荷叶总生物碱具有明显抑制细菌 生长的作用，其单体鹅掌楸碱对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC均为32μ g/mL，杏黄罂粟碱对红色毛癣菌和石膏状小孢子菌的MIC均为16yg/mL，0-去甲基荷叶碱对 金黄色葡萄球菌的抑制作用与氯霉素相当。在农作物侵染性病害中，主要有真菌性病害和 细菌性病害两种，其中真菌性病害约占病害的70~80%。一种作物上可发现几种甚至几十 种真菌病害。目前主要采取农药喷施方法对其进行防治。由于大量农药的使用对环境和人 畜造成了深远而惨重的危害。因此，充分挖掘尚未得到合理利用的资源，从植物中发现开发 高效低毒的天然有效抗菌活性成分成为一条重要途径，符合绿色思维的发展潮流。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供， 旨在解决目前主要采取农药喷施方法对植物病原真菌进行防治，大量农药的使用对环境和 人畜造成了深远而惨重危害的问题。 本专利技术是这样实现的，一种荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法，所述荷 叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法包括： 孢子悬液的制备:将保存菌种接入马铃薯固体培养基的试管斜面活化，取一支生 长4d的试管斜面，用50mL的0.9%的无菌生理盐水倒入试管中，用无菌的玻棒在斜面上搅 动，将孢子刮下来，并用两层纱布过滤，装入三角瓶中，用血球板计数法和平皿计数法测定 其生长浊度，将孢子悬液稀释； 经微波辅助热回流法提取、D -101型大孔吸附树脂纯化、冷冻干燥得到，其中荷叶 碱含量为1.37%，取荷叶总生物碱固体适量，溶解，配置总生物碱溶液，调节pH，将溶液用微 量小滤器过滤除菌后用于体外抑菌试验； 采用管碟法。待培养基冷却到50°C时，加入2mL孢子悬液，摇匀，倒入直径为12cm培 养皿中，待凝固后，将牛津杯放置平皿菌层上，每杯加入荷叶总生物碱，观察抑菌圈的大小； 采用试管倍比稀释法，分别用50%乙醇溶液置备荷叶总生物碱，分别吸取以上浓 度的荷叶总生物碱lmL加入到19mL液体培养基中，再加入0.2mL孢子悬液，30°C培养48h，从 试管中吸取〇.2mL的培养液，加入固体培养基中，涂布均匀，倒置放入30°C的恒温培养箱中， 培养48h，观察，未长菌平皿的最高稀释浓度为荷叶总生物碱最低杀菌浓度； 采用平皿倍比稀释法，培养皿中加入19. OmL培养基，待培养基还未凝固时，分别在 各个培养皿中加入浓度为10mg/mL、5mg/mL、2 · 5mg/mL、1 · 25mg/mL、0 · 625mg/mL、0 · 312mg/ mL、0.16mg/mL荷叶总生物碱溶液1. OmL，摇匀，同时以50%乙醇为对照，待培养凝固后，向各 平皿中加入0.2mL孢子悬液，涂布均匀，30°C倒置培养48h，观察，未长菌平皿的最高稀释浓 度为荷叶总生物碱的最低抑菌浓度。 进一步，所述用血球板计数法和平皿计数法测定其生长浊度，将孢子悬液稀释到 105~106cuf. · mL_1〇 进一步，所述取荷叶总生物碱固体适量，用50%乙醇溶解，配置成1〇11^/1111^和5〇11^/ mL总生物碱溶液，调节pH为8。 进一步，所述每杯分别加入211^/1111^、411^/1111^、1〇11^/1]11^荷叶总生物碱0.251]1匕30°0|'亘 温培养48h，观察抑菌圈的大小，抑菌圈的评判标准为:d < 8mm为不敏感型，8mm<d < 13mm为 低度敏感型，13mm<cK 19mm为中度敏感型，d>19mm为高度敏感型。 进一步，所述采用试管倍比稀释法，分别用50 %乙醇溶液置备10mg/mL、5mg/mL、 2 · 5mg/mL、1 · 25mg/mL、0 · 625mg/mL、0 · 32mg/mL、0 · 16mg/mL 荷叶总生物喊。 本专利技术的另一目的在于提供一种所述荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方 法的稻瘟病菌抑菌活性应用。 本专利技术的另一目的在于提供一种所述荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方 法的黄瓜枯萎病菌抑菌活性应用，最低抑菌浓度和最低杀菌浓度均为160yg/mL。 本专利技术的另一目的在于提供一种所述荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方 法的油菜菌核菌抑菌活性应用。 本专利技术的另一目的在于提供一种所述荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方 法的红菇根霉菌抑菌活性应用。 本专利技术的另一目的在于提供一种所述荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方 法的小麦赤霉菌抑菌活性应用。 本专利技术提供的荷叶总生物碱对6种植物病原真菌抑制活性方法及应用，其中对黄 瓜枯萎病菌的抑菌活性最强，对油菜菌核菌和红菇根霉菌活性较强，对水稻稻瘟菌、小麦赤 霉病菌和辣椒疫病菌有一定抑制作用。该方法的应用为从植物中发现开发高效低毒的天然 有效抗菌活性成分，从而降低农药喷施防治植物病原真菌提供一条重要途径。本专利技术采用 本实验室纯化的荷叶总生物碱进行了体外抑制植物病原真菌效果的研究，以期为荷叶中天 然活性化合物的有效开发利用提供依据。【附图说明】 图1是本专利技术实施例提供的荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法流程图。【具体实施方式】 为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于 限定本专利技术。 下面结合附图及具体实施例对本专利技术的应用原理作进一步描述。 如图1所示，本专利技术实施例的荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法包括以 下步骤： S101:孢子悬液的制备:将保存菌种接入马铃薯固体培养基的试管斜面活化，取一 支生长4d的试管斜面，用50mL的0.9%的无菌生理盐水分几次倒入试管中，其间用无菌的玻 棒在斜面上轻轻搅动，将孢子刮下来，并用两层纱布过滤，装入三角瓶中，用血球板计数法 和平皿计数法测定其本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法，其特征在于，所述荷叶总生物碱对植物病原真菌抑制活性方法包括：孢子悬液的制备：将保存菌种接入马铃薯固体培养基的试管斜面活化，取一支生长4d的试管斜面，用50mL的0.9％的无菌生理盐水倒入试管中，用无菌的玻棒在斜面上搅动，将孢子刮下来，并用两层纱布过滤，装入三角瓶中，用血球板计数法和平皿计数法测定其生长浊度，将孢子悬液稀释；经微波辅助热回流法提取、D－101型大孔吸附树脂纯化、冷冻干燥得到，其中荷叶碱含量为1.37％，取荷叶总生物碱固体适量，溶解，配置总生物碱溶液，调节pH，将溶液用微量小滤器过滤除菌后用于体外抑菌试验；采用管碟法，待培养基冷却到50℃时，加入2mL孢子悬液，摇匀，倒入直径为12cm培养皿中，待凝固后，将牛津杯放置平皿菌层上，每杯加入荷叶总生物碱，观察抑菌圈的大小；采用试管倍比稀释法，分别用50％乙醇溶液置备荷叶总生物碱，分别吸取以上浓度的荷叶总生物碱1mL加入到19mL液体培养基中，再加入0.2mL孢子悬液，30℃培养48h，从试管中吸取0.2mL的培养液，加入固体培养基中，涂布均匀，倒置放入30℃的恒温培养箱中，培养48h，观察，未长菌平皿的最高稀释浓度为荷叶总生物碱最低杀菌浓度；采用平皿倍比稀释法，培养皿中加入19.0mL培养基，待培养基还未凝固时，分别在各个培养皿中加入浓度为10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.312mg/mL、0.16mg/mL荷叶总生物碱溶液1.0mL，摇匀，同时以50％乙醇为对照，待培养凝固后，向各平皿中加入0.2mL孢子悬液，涂布均匀，30℃倒置培养48h，观察，未长菌平皿的最高稀释浓度为荷叶总生物碱的最低抑菌浓度。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：肖桂青，卢向阳，魏琦超，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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