一种检测海洋多糖生物活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测海洋多糖生物活性的方法，包括以下步骤：步骤1，将海洋多糖样品配制成一定浓度的多糖溶液；步骤2，将巨噬细胞调整至一定的细胞密度；步骤3，利用步骤1的多糖溶液和步骤2得到的细胞液配置一系列混合液，混合液的巨噬细胞的细胞密度相同，海洋多糖的浓度不同；然后进行巨噬细胞细胞培养；步骤4，取步骤3得到的培养物收集细胞上清液；步骤5，取步骤4得到的细胞上清液用电子自旋共振波谱法检测氮氧自由基NO·的浓度，检测值的高低说明被检测多糖样品的体外免疫调节活性高低。本发明专利技术具有检测范围广、检测对象广泛、检测条件简单、检测灵敏度高等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于水产品生物活性检测
，特别是涉及一种检测海洋多糖生物活性的方法。
技术介绍
自然界中的植物、动物及微生物体内都含有多糖。多糖在医药及食品保健领域迅速发展，具有很好的开发前景。海洋生物由于特殊的生活环境，导致海洋生物体内多糖的合成过程与陆地生物不同，并产生许多结构新颖，作用特殊的活性物质，其中不少海洋生物特有显著的抗肿瘤功能和免疫调节作用，具有很高的研究价值。海洋生物多糖根据来源不同可分为三大类，海藻多糖，海洋动物多糖和海洋微生物多糖。不同多糖的生物活性有所差别，活性高低受多糖的结构、分子量等多种因素影响，多糖类药品及保健品的功效存在很大差异，检测海洋多糖的生物活性是判断多糖药品及保健品功效的方法之一。传统的动物学实验检测多糖活性方法存在动物个体差异、工作量大、资金消耗多等问题。因此，建立一种新的检测海洋多糖调节巨噬细胞内NO生成的方法势在必行。体外免疫调节活性的检测通常采用的是Griess试剂盒法，在检测过程中酶标仪发挥着重要的作用。酶标仪检测是根据细胞群体染色后的吸光值大小判断细胞活性。其中Griess试剂盒是检测细胞分泌到上清液中的NO浓度的常用方法。细胞经多糖样品处理后，分泌NO到上清液中，此时NO极易氧化生成NO2-，在酸性条件下，NO2-促使Griess反应发生而生成重氮化合物，使溶液显色，从而在540nm处测定各孔的OD值。通过标准曲线的计算，将r>OD值换算成NO浓度。该方法的不足是仅通过OD值来间接反映上清液中NO的量，而不能像本方法一样直接检测上清液中NO·自由基的量从而反映NO浓度，准确度和创新性较差。有关电子自旋共振波谱技术迄今还未见涉及体外(细胞体系)检测相关专利，亦未见利用电子自旋共振波谱技术检测NO的相关专利，故利用电子自旋共振波谱技术对于海洋多糖活性更深入的研究将具有突破性的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测海洋多糖生物活性的方法，以解决利用动物学实验检测多糖活性方法存在动物个体差异、工作量大、资金消耗多的技术问题。一种检测海洋多糖生物活性的方法，包括以下步骤：步骤1，将海洋多糖样品配制成一定浓度的多糖溶液；优选地，在步骤1中，利用达尔伯克改良伊格尔培养基配制多糖溶液。DMEM(dulbecco'smodifiedeaglemedium达尔伯克改良伊格尔培养基)步骤2，将巨噬细胞调整至一定的细胞密度；优选地，在步骤2中，所述巨噬细胞为RAW264.7巨噬细胞。更优选地，在步骤2中，RAW264.7巨噬细胞的浓度为105～106个/ml。优选地，在步骤2中，利用达尔伯克改良伊格尔培养基调节细胞密度。步骤3，利用步骤1的多糖溶液和步骤2得到的细胞液配置一系列混合液，混合液的巨噬细胞的细胞密度相同，海洋多糖的浓度不同；然后进行巨噬细胞细胞培养；优选地，在步骤3中，混合液中海洋多糖的浓度在0～200μg/ml之间。优选地，步骤3中，进行巨噬细胞培养的条件为：置于37℃、CO2体积浓度为5％的二氧化碳培养箱内培养48h。步骤4，取步骤3得到的培养物收集细胞上清液；步骤5，取步骤4得到的细胞上清液用电子自旋共振波谱法检测氮氧自由基NO·的浓度，检测值的高低说明被检测多糖样品的体外免疫调节活性高低。优选地，步骤5中检测氮氧自由基NO·的浓度的过程如下：1)向细胞上清液中加入NO·自由基捕获剂；2)用石英毛细管吸取1)中混合液至适当高度，用凡士林封毛细管下口；3)电子自旋共振波谱仪检测NO·自由基生成情况，得到检测值；电子自旋共振波谱仪检测具体参数如下：X-波段；调制频率100kHz；谐振频率9.4GHz；微波功率25mW；调制幅度0.25mT；中心磁场356mT；扫描时间30s；扫描宽度10mT；时间常数0.1s；温度26℃。优选地，所述自由基捕获剂为含有10mmol·L-1MGD和2mmol·L-1FeSO4的溶液。MGD是DETC的衍生物，全称为：methyl-D-glucaminedithiocarbamate，甲基葡萄糖胺二硫代氨基甲酸盐。本专利技术采用稳定的单核巨噬细胞株RAW264.7细胞，通过细胞上清液中NO·自由基含量来评价海洋多糖免疫调节活性，降低了检测难度，提高了检测结果的稳定性，丰富了检测方法，有望应用于细胞生物学，药物分析，环境毒性物质检测等相关领域。本专利技术采用的检测方法为电子自旋共振波谱检测技术，其具有检测范围广、检测对象广泛、检测条件简单、检测灵敏度高等优点。当经药物刺激后的细胞上清液中NO浓度很低时，利用普通的方法可能不能检出，但利用本方法将大大提高灵敏度。本专利技术实现了快速有效检测海洋多糖免疫调节活性，检测过程简洁，检测结果稳定可靠，并且本专利技术从自由基的角度为该方面的检测拓宽了思路。附图说明图1为实施例1的得到(MGD)2-Fe2+-NO信号图谱；图2为实施例2的得到(MGD)2-Fe2+-NO信号图谱；图3为实施例3的得到(MGD)2-Fe2+-NO信号图谱；图4为不同浓度(MGD)2Fe2+-NO所对应的ESR谱。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本专利技术所述检测海洋多糖生物活性的方法的实施方式包括以下步骤：步骤1，将海洋多糖样品配制成一定浓度的多糖溶液；在步骤1中，利用达尔伯克改良伊格尔培养基配制多糖溶液。DMEM(dulbecco'smodifiedeaglemedium达尔伯克改良伊格尔培养基)步骤2，将巨噬细胞调整至一定的细胞密度；在步骤2中，所述巨噬细胞为RAW264.7巨噬细胞。在步骤2中，RAW264.7巨噬细胞的浓度为105～106个/ml。在步骤2中，利用达尔伯克改良伊格尔培养基调节细胞密度。步骤3，利用步骤1的多糖溶液和步骤2得到的细胞液配置一系列混合液，混合液的巨噬细胞的细胞密度相同，海洋多糖的浓度不同；然后进行巨噬细胞细胞培养；在步骤3中，混合液中海洋多糖的浓度在0～200μg/ml之间。步骤3中，进行巨噬细胞培养的条件为：置于37℃、CO2体积浓度为5％的二氧化碳培养箱内培养48h。步骤4，取步骤3得到的培养物收集细胞上清液；步骤5，取步骤4得到的细胞上清液用电子自旋共振波谱法检测氮氧自由基NO·的浓度，检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测海洋多糖生物活性的方法，包括以下步骤：步骤1，将海洋多糖样品配制成一定浓度的多糖溶液；步骤2，将巨噬细胞调整至一定的细胞密度；步骤3，利用步骤1的多糖溶液和步骤2得到的细胞液配置一系列混合液，使混合液的巨噬细胞的细胞密度相同，海洋多糖的浓度不同；然后进行巨噬细胞细胞培养；步骤4，取步骤3得到的培养物收集细胞上清液；步骤5，取步骤4得到的细胞上清液用电子自旋共振波谱法检测氮氧自由基NO·的浓度，检测值的高低说明被检测多糖样品的体外免疫调节活性高低。

【技术特征摘要】
1.一种检测海洋多糖生物活性的方法，包括以下步骤：
步骤1，将海洋多糖样品配制成一定浓度的多糖溶液；
步骤2，将巨噬细胞调整至一定的细胞密度；
步骤3，利用步骤1的多糖溶液和步骤2得到的细胞液配置一系列混合
液，使混合液的巨噬细胞的细胞密度相同，海洋多糖的浓度不同；然后进行
巨噬细胞细胞培养；
步骤4，取步骤3得到的培养物收集细胞上清液；
步骤5，取步骤4得到的细胞上清液用电子自旋共振波谱法检测氮氧自
由基NO·的浓度，检测值的高低说明被检测多糖样品的体外免疫调节活性
高低。
2.根据权利要求1检测海洋多糖生物活性的方法，其特征在于，在步
骤1中，利用达尔伯克改良伊格尔培养基配制多糖溶液。
3.根据权利要求1所述的检测海洋多糖生物活性的方法，其特征在于，
在步骤2中，所述巨噬细胞为RAW264.7巨噬细胞。
4.根据权利要求3检测海洋多糖生物活性的方法，其特征在于，在步
骤2中，RAW264.7巨噬细胞的浓度为105～106个/ml。
5.根据权利要求2或3检测海洋多糖生物活性的方法，其特征在于，
在步骤2中，利用达尔伯克改良伊格尔培养基调节细胞密度...

【专利技术属性】
技术研发人员：启航，李楠，董秀芳，冯丁丁，粱潇月，董秀萍，姜鹏飞，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21