一种高活性花生壳多糖及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高活性花生壳多糖及其制备方法，属于天然产物制备的技术领域。本发明专利技术采用定点突变的方式获得内切葡聚糖酶和外切纤维素酶的突变体，并进行复配，采用超声波辅助酶解与提取的方式，从花生壳中同步获取活性多糖与黄酮类化合物。本发明专利技术采用的复合酶及制备工艺提高了复合酶最适水解温度及酶活，简化了操作步骤，节约了提取时间，不仅实现了同步制取花生壳黄酮类化合物与水溶性多糖，并且实现了中高温条件下多糖的同步酶解和提取，所得活性多糖中黄酮含量高，抗氧化活性和抑菌性强，具有多种生理功能，应用范围广。

【技术实现步骤摘要】
一种高活性花生壳多糖及其制备方法
本专利技术涉及一种高活性花生壳多糖及其制备方法，属于天然产物制备的

技术介绍
多糖类物质一般是存在生物活体内的一种天然物质，直接参与生物体的基本代谢过程，对生物体的代谢过程产生积极影响。具有预防心血管疾病、预防糖尿病、清除人体有害物质、提高人体免疫力等显著的生理功能。可以作为预防、减轻症状、辅助治疗心血管等疾病的功能性食品，也可以作为食品添加剂或营养强化剂广泛应用于食品、保健品以及医药制品中，以补充人体所需的膳食纤维量，增加产品保健功能，改进产品风味，提高产品品质和附加值等。活性多糖的提取方法包括化学法、酶法、化学-酶结合法、发酵法、超声辅助法、微波辅助法等多种方法。黄酮类化合物是泛指具有15个碳原子的多元酚化合物，广泛存在于自然界，具有多种生物活性，在体内具有改善微循环、改变体内酶活性、降血脂、降胆固醇、抗自由基、抗氧化、增强免疫功能、抑菌、抗病毒和抗炎症等多种功能活性。正是因其所具备的多种调节人体生理功能和治疗人类疾病的作用而使黄酮类物质成为目前高端功能性营养化学品的代表，产品利润、市场空间远高于一般的食品或健康食品。目前，通常采用化学法合成、植物提取以及运用微生物生物合成等方式获取黄酮类物质。我国是世界上最大的花生生产国和消费国，在花生加工利用过程中，每年产生几百万吨的花生壳废弃物，除少部分加工成为粗饲料和可食用菌的培养基外，多数花生壳作为燃料或成为垃圾，而花生壳约占花生重量的三分之一，含有有65%-80%的粗纤维素、10%的半纤维素以及其他一些活性成分并未得到有效的开发利用，资源浪费严重。本专利技术运用生物学手段结合农产品加工技术将花生壳中的纤维素进行改性处理，获得富含黄酮类化合物的高活性花生壳多糖，所得产品绿色安全，可应用于功能食品中，不仅为花生壳资源的高值化利用提供生产依据，延长花生加工产业链，而且契合人们的消费需求，具有重要的应用与经济价值。纤维素酶在分解纤维素时起生物催化作用，可以将纤维素分解成寡糖或单糖。纤维素酶根据其催化反应功能的不同可分为内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶。内切葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定型区，产生不同长度的寡糖和新链的末端。外切葡聚糖酶作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端，释放葡萄糖或纤维二糖。研究认为纤维素的水解是两种的酶协同作用，才能将纤维素彻底的水解。我们发现商业化纤维素酶可以使花生壳中纤维素水解获得活性多糖，但是目前商业化纤维素酶酶解最适温度为50-60℃而多糖的最佳提取温度为60-80℃，为了防止纤维素酶的失效，必须将酶解与提取分为两步进行。因此提取效率低，提取时间长，耗能低。本专利技术通过对来源于里氏木霉的内切葡聚糖酶1EGI和外切纤维素酶1CEL内部氨基酸进行定点突变，获得了耐高温的纤维素酶复合酶，将两种酶的最适温度提高了10度以上。使用本专利技术的纤维素酶复合酶可以有效解决当前多糖制备过程中酶解与提取不能同步进行的问题，酶制剂用量少，提取时间短，提取效率高，多糖活性好，黄酮含量高。
技术实现思路
本专利技术提供了一种耐高温且能高效降解花生壳的复合酶，其降解产物为富含黄酮的花生多糖。该复合酶由内切葡聚糖酶突变体和外切纤维素酶突变体组成，所述突变是对氨基酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.3所示的来源于里氏木霉的内切葡聚糖酶1EGI和外切纤维素酶1CEL内部氨基酸进行定点突变，从而提高了两种突变体所组成的复合酶的酶解温度。所述突变是将内切葡聚糖酶1EGI第99位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，第241位的天冬氨酸突变为亮氨酸，得到突变体1EGIS99FD241L；将外切纤维素酶1CEL第210位的半胱氨酸突变为赖氨酸，得到突变体1CELQ210K。在本专利技术的一种实施方式中，所述内切葡聚糖酶突变体1EGIS99FD241L、外切纤维素酶突变体1CELQ210K的氨基酸序列分别如SEQIDNO:2、SEQIDNO:4所示。本专利技术的第二个目的是提供一种提高内切葡聚糖酶1EGI和外切纤维素酶1CEL高温下水解花生壳活性的方法，是将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的内切葡聚糖酶蛋白质分子内部第99位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，第241位的天冬氨酸突变为亮氨酸，将氨基酸序列如SEQIDNO.3所示的外切纤维素酶蛋白质分子内部第210位的半胱氨酸突变为赖氨酸。关于突变体命名：以“酶分子亲本氨基酸位点取代后氨基酸”表示突变体，比如1CELC210K，是指在外切纤维素酶亲本氨基酸序列的基础上将第104位的氨基酸S（丝氨酸，Ser）突变为氨基酸A（丙氨酸，Ala）第210位的半胱氨酸C突变为赖氨酸K。本专利技术中，以SEQIDNO.1所示的序列为内切葡聚糖酶亲本序列，以SEQIDNO.2所示的序列为外切纤维素酶亲本序列。本专利技术的第三个目的是提供一种富含黄酮类化合物的活性多糖的制备方法，包括如下制备步骤：（1）花生壳经清洗、烘干、超微粉碎后与水混合，添加由内切葡聚糖酶突变体和外切纤维素酶突变体组成的复合酶，超声波辅助酶解和提取花生壳中的水溶性多糖和黄酮类化合物；（2）真空抽滤步骤（1）所得混合物，保留抽滤液，并经真空旋转蒸发得到浓缩液，浓缩液冷却后，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12h，离心收集沉淀，同时保留上清液；（3）步骤（2）所得沉淀加水复溶，离心收集上清液，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12h，离心收集沉淀，经真空干燥得到活性多糖；（4）步骤（2）所得上清液经真空旋转蒸发除去乙醇，选择截留分子量为20kDa的超滤膜进行超滤，保留透过液，所得透过液溶解步骤（3）所得活性多糖，该混合物经冷冻干燥获得富含黄酮类化合物的活性多糖。所述内切葡聚糖酶突变体与外切纤维素酶突变体复配的比例为5:4~3:1。所述超声波辅助酶解的条件为：按料液比1:10~1:30混合粉碎的花生壳与水，每50g花生壳添加0.5~2.2g复合酶，60-80℃下超声波辅助酶解和提取3-15min。本专利技术还要求保护所述富含黄酮类化合物的活性多糖，或者利用生产富含黄酮类化合物的活性多糖的方法生产得到的富含黄酮类化合物的活性多糖在食品、农业或制备药物方面的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术通过定点突变的方式，分别将内切葡糖酶和外切纤维素酶底物结合位点和酶反应中心活性位点中的氨基酸进行突变，提高了二者的最适反应温度和高温环境的酶活稳定性，同时提高了对花生壳的水解活性；并通过复配两种酶蛋白的突变体实现高效制备花生壳活性多糖，活性多糖得率达到90%，在同等条件下，比野生型酶蛋白酶解花生壳后的多糖得率提高了70%，比商业纤维素酶制剂酶解后的多糖得率提高了38.8%。运用该复合酶加工处理花生壳实现了多糖酶解和提取的同步进行，比传统提取方法减少一个操作步骤，节省提取时间50%以上适合大规模工业生产。本专利技术的另一个有益效果是采用超声波辅助复合酶酶解及提取的工艺方法，实现了高效同步制备活性多糖和黄酮类化合物的目的，并采用乙醇沉淀结合超滤分离的方法获得了富含黄酮类化合物的活性多糖，其中黄酮含量高达18.1mg/g，普通花生多糖中黄酮含量低于4mg/g。所得富含黄酮类化合物的活性多糖具有显著的抗氧化活性和抑菌活性，阳离子交换能力高、，具有增强免疫功能、抑菌、抗病毒和抗炎症等多种功能活本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高活性花生壳多糖及其制备方法，包括如下步骤：（1）花生壳经清洗、烘干、超微粉碎后与水混合，添加由内切葡聚糖酶突变体和外切纤维素酶突变体组成的复合酶，超声波辅助酶解和提取花生壳中的水溶性多糖和黄酮类化合物；（2）真空抽滤步骤（1）所得混合物，保留抽滤液，并经真空旋转蒸发得到浓缩液，浓缩液冷却后，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12 h，离心收集沉淀，同时保留上清液；（3）步骤（2）所得沉淀加水复溶，离心收集上清液，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12 h，离心收集沉淀，经真空干燥得到活性多糖；（4）步骤（2）所得上清液经真空旋转蒸发除去乙醇，选择截留分子量为20 kDa的超滤膜进行超滤，保留透过液，所得透过液溶解步骤（3）所得活性多糖，该混合物经冷冻干燥获得富含黄酮类化合物的活性多糖。

【技术特征摘要】
1.一种高活性花生壳多糖及其制备方法，包括如下步骤：（1）花生壳经清洗、烘干、超微粉碎后与水混合，添加由内切葡聚糖酶突变体和外切纤维素酶突变体组成的复合酶，超声波辅助酶解和提取花生壳中的水溶性多糖和黄酮类化合物；（2）真空抽滤步骤（1）所得混合物，保留抽滤液，并经真空旋转蒸发得到浓缩液，浓缩液冷却后，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12h，离心收集沉淀，同时保留上清液；（3）步骤（2）所得沉淀加水复溶，离心收集上清液，加入预冷的乙醇，并于4℃条件下放置12h，离心收集沉淀，经真空干燥得到活性多糖；（4）步骤（2）所得上清液经真空旋转蒸发除去乙醇，选择截留分子量为20kDa的超滤膜进行超滤，保留透过液，所得透过液溶解步骤（3）所得活性多糖，该混合物经冷冻干燥获得富含...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙杰，毕洁，张初署，于丽娜，王明清，徐同城，杨伟强，张建成，
申请(专利权)人：山东省花生研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37