一种具有免疫活性和抗肿瘤作用的均一天花粉多糖及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种具有免疫活性和抗肿瘤作用的均一天花粉多糖及其应用。该多糖从中药天花粉中提取分离得到，为白色絮状固体，易溶于水，由碳、氢、氧3种元素组成，比旋光度(H2O)为+165.58，重均相对分子量(Mw)为1.76×104，其糖基组成主要是葡萄糖。RTPS-Ⅰ能促进人外周血单个核细胞(PBMC)的增殖，上调人PBMC中T淋巴细胞亚群以及刺激人PBMC分泌产生TNF-α、IL-6细胞因子，其免疫活性作用明显强于天花粉总多糖；RTPS-Ⅰ对人宫颈癌细胞(HeLa细胞)和人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)的生长有显著抑制作用。可用于免疫调节佐剂的开发和作为抗肿瘤药物的先导化合物。

【技术实现步骤摘要】
一种具有免疫活性和抗肿瘤作用的均一天花粉多糖及其应用
本专利技术涉及传统中药材天花粉的生物活性成分多糖，属于医药生物

技术介绍
天花粉(RadixTrichosanthis)作为一种传统的中草药，有着千余年的中医中药临床应用经验。临床上主治宫外孕、葡萄胎、胎盘残留和滋养层细胞肿瘤等。现代研究表明，天花粉中富含蛋白质、多糖、植物凝血素、皂苷和黄酮类等多种化学成分。其中天花粉蛋白已经被分离鉴定，并证实具有抗肿瘤等多种生物活性。对于天花粉中的多糖成分却少有研究。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种具有免疫活性和抗肿瘤作用的均一天花粉多糖。为此，本专利技术采用以下技术方案：一种具有免疫活性和抗肿瘤作用的均一天花粉多糖，其特征在于其为对天花粉总多糖分离纯化后得到的均一天花粉多糖(RTPS-Ⅰ)：所述均一天花粉多糖(RTPS-Ⅰ)为白色絮状固体，易溶于水，pH中性，不溶于乙醇、乙醚、丙酮；所述均一天花粉多糖(RTPS-Ⅰ)由碳、氢、氧3种元素组成，不含氮；比旋光度为+165.58；相对黏度12.5/mPa.s(20℃，浓度＝3％)；重均相对分子量(Mw)为1.76×104，数均相对分子量(Mn)为9.28×103；本专利技术均一天花粉多糖RTPS-Ⅰ的结构信息：⑴糖基组成主要是葡萄糖；⑵不含有糖醛酸；⑶糖环为吡喃环；⑷各单糖以α-型糖苷键相连接。进一步地，本专利技术所提供的均一天花粉多糖为采用以下方法对天花粉总多糖分离纯化得到的均一天花粉多糖(RTPS-Ⅰ)：通过DEAE-纤维素柱色谱初步分离，0～0.5mol﹒L-1NaCl梯度洗脱，合并峰位洗脱液，透析除盐、浓缩，获得的产品经DEAE-琼脂糖凝胶FF色谱柱进一步分离，0～0.8mol﹒L-1NaCl梯度洗脱，得到各洗脱组分，透析除盐、浓缩、冷冻干燥；再将各洗脱组分经葡聚糖凝胶G-200色谱柱以0.2mol﹒L-1NaCl为洗脱剂进一步纯化，浓缩除盐，透析，再浓缩，冷冻干燥，得到各天花粉精制多糖组分，其中含量最高的为天花粉多糖(RTPS-Ⅰ)。检测纯度，天花粉多糖(RTPS-Ⅰ)在高效凝胶过滤色谱上呈单一对称峰。进一步地，所述天花粉总多糖为不含蛋白质、核酸的中性纯粹天花粉多糖，可通过水提、脱蛋白、透析、醇沉方法从天花粉中获得不含蛋白质、核酸的中性纯粹天花粉多糖，得率为2.64％，苯酚-硫酸法测定天花粉多糖含量为85.8％。更进一步地，所述天花粉总多糖采用以下方法制得：将天花粉药材粉碎，石油醚回流脱脂8小时，加15倍水量，70℃提取，减压浓缩，加95％乙醇沉淀。用三氯乙酸(TCA)法脱蛋白，离心除去蛋白质沉淀，透析，浓缩，醇沉多糖，沉淀再用无水乙醇、丙酮和乙醚依此洗涤，冷冻干燥。本专利技术还提供了均一天花粉多糖(RTPS-Ⅰ)在制备免疫调节制剂中的应用以及在制备抗乳腺癌和抗宫颈癌药物中的应用。本专利技术提供的均一天花粉多糖(RTPS-Ⅰ)对人外周血单个核细胞(PBMC)有明显促增殖和活化作用，上调T淋巴细胞亚群中CD3+、CD4+、CD8+T细胞的含量，并可诱导人PBMC高水平分泌产生TNF-α、IL-6细胞因子，显示出良好的免疫活性。本专利技术提供的均一天花粉多糖(RTPS-Ⅰ)对人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)和人子宫颈癌细胞(HeLa细胞)生长均可产生明显抑制作用，MCF-7和HeLa细胞主要出现细胞膜皱缩，核质浓缩等肿瘤细胞生长抑制现象。本专利技术制备的均一天花粉多糖RTPS-Ⅰ具备良好的免疫活性和抗肿瘤作用，有望开发成具有免疫调节作用和抗肿瘤作用的制剂。在医药、保健食品、生物技术等领域具有潜在的应用前景。附图说明图1为DEAE-琼脂糖凝胶FF柱色谱分离天花粉多糖的洗脱曲线图。图2为均一天花粉多糖(RTPS-Ⅰ)高效凝胶渗透色谱图。图3为均一天花粉多糖(RTPS-Ⅰ)的红外图谱。具体实施方式实施例1：天花粉总多糖的制备将天花粉药材(栝楼TrichosantheskirilowiiMaxim的干燥根，产地：浙江平湖)粉碎机粉碎，取粉末500g，石油醚回流脱脂8小时，药渣加15倍水量，70℃提取2小时，重复3次，离心，合并上清液，减压浓缩至原有体积的1/4，加95％乙醇使醇终浓度为80％，室温下静止10小时，析出多糖粗品沉淀。用三氯乙酸(TCA)法脱蛋白，使溶液中TCA浓度达6％，放置，离心除去蛋白质沉淀，紫外扫描260、280nm无蛋白质和核酸的吸收峰。上清液对蒸馏水透析48小时，浓缩透析液，加三倍量无水乙醇醇析多糖，静置24h，沉淀再用无水乙醇、丙酮和乙醚依此洗涤，冷冻干燥。得率为2.64％；多糖含量为85.8％。实施例2：均一天花粉多糖(RTPS-Ⅰ)的制备取实施例1得到的天花粉总多糖经DEAE-纤维素(OH-，4cm×60cm)柱色谱分离，用0～0.5mol﹒L-1NaCl梯度洗脱，10min收集一管，每管6mL。硫酸-苯酚法显色，收集含糖部分，透析、浓缩、干燥后取多糖组分上DEAE-琼脂糖凝胶FF(Cl-，2.5cm×50cm)色谱柱，0～0.8mol﹒L-1NaCl(pH7.5)梯度洗脱，硫酸-苯酚法显色，收集各洗脱组分，透析、浓缩、冷冻干燥，其中含量最高的为天花粉多糖RTPS-Ⅰ。上述多糖组分RTPS-Ⅰ再用葡聚糖凝胶G-200(Cl-，2.6cm×90cm)凝胶过滤色谱进一步纯化，以0.2mol﹒L-1NaCl作为溶剂和洗脱剂。根据洗脱曲线收集、合并含糖部分，浓缩，透析，再浓缩，冷冻干燥。检测纯度，直到在高效凝胶过滤色谱上呈单一对称峰为止。实施例3：均一天花粉多糖(RTPS-Ⅰ)的免疫活性试验(1)均一天花粉多糖(RTPS-Ⅰ)促人PBMC淋巴细胞增殖作用。人外周血单个核细胞(PBMC)，以每孔100μL接种于96孔培养板中，于37℃、5％CO2培养箱中经24小时预培养后，分别加入以2.0％小牛血清(FCS)RPMI1640培养液配制的均一天花粉多糖RTPS-Ⅰ溶液，同时以终浓度为10mmol﹒L-1的植物凝血素(PHA)为阳性对照组，等量10％FCSRPMI1640为阴性对照组。经37℃、5％CO2培养72小时后，2000r﹒min-1离心10min，小心吸取上清液，每孔加入5mg﹒mL-1四氮唑蓝(MTT)50μL，继续孵育4小时。离心弃上清液后，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，振荡器振荡20min，570nm检测吸光值(A)。计算刺激指数(SI)，SI＝实验组A570nm值/对照组A570nm值。结果表明：0.16～3.2mmol﹒L-1RTPS-Ⅰ具有显著的促人PBMC淋巴细胞增殖作用，与10％FCSRPMI1640阴性对照组比较具有统计学意义(P＜0.05)，并且随着RTPS-Ⅰ的浓度增高，其促淋巴细胞增殖作用逐步增强。其中3.0mmol﹒L-1RTPS-Ⅰ的促淋巴细胞增殖作用与50mg﹒mL-1PHA的作用相似，两者比较无显著性差异(P＞0.05)。(2)流式细胞仪检测均一天花粉多糖(RTPS-Ⅰ)刺激人PBMC中T淋巴细胞亚群的变化。以上述相同方法，分别加入均一天花粉多糖(RTPS-Ⅰ)溶液，以等量10％FCSRPMI1640为空白对照。经37℃、5％CO2培养48小时后，1500r﹒min-1离心3min，弃上清液，加入CD本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有免疫活性和抗肿瘤作用的均一天花粉多糖，其特征在于其为对天花粉总多糖分离纯化得到的均一天花粉多糖(RTPS‑Ⅰ)：所述均一天花粉多糖(RTPS‑Ⅰ)为白色絮状固体，易溶于水，pH中性，不溶于乙醇、乙醚、丙酮；所述均一天花粉多糖(RTPS‑Ⅰ)由碳、氢、氧3种元素组成，不含氮；比旋光度为+165.58；相对黏度12.5/mPa.s(20℃，浓度＝3％)；其糖基组成主要是葡萄糖，不含有糖醛酸，糖环为吡喃环，各单糖以α‑型糖苷键相连接；重均相对分子量(Mw)为1.76×104，数均相对分子量(Mn)为9.28×103。

【技术特征摘要】
1.一种具有免疫活性和抗肿瘤作用的均一天花粉多糖，其特征在于其为对天花粉总多糖分离纯化得到的均一天花粉多糖：所述均一天花粉多糖为白色絮状固体，易溶于水，pH中性，不溶于乙醇、乙醚、丙酮；所述均一天花粉多糖由碳、氢、氧3种元素组成，不含氮；比旋光度为+165.58；在20℃，浓度＝3％条件下的相对黏度12.5mPa.s；其糖基组成主要是葡萄糖，不含有糖醛酸，糖环为吡喃环，各单糖以α-型糖苷键相连接；重均相对分子量(Mw)为1.76×104，数均相对分子量(Mn)为9.28×103。2.如权利要求1所述的一种具有免疫活性和抗肿瘤作用的均一天花粉多糖，其特征在于其为采用以下方法对天花粉总多糖分离纯化得到均一天花粉多糖：通过DEAE-纤维素柱色谱初步分离，0～0.5mol﹒L-1NaCl梯度洗脱，合并峰位洗脱液，透析除盐、浓缩，获得的产品经DEAE-琼脂糖凝胶FF色谱柱进一步分离，0～0.8mol﹒L-1NaCl梯度洗脱，得到各洗脱组分，透析除盐、浓缩、冷冻干燥；再将各洗脱组分经葡...

【专利技术属性】
技术研发人员：屠婕红，徐水凌，黄佳，
申请(专利权)人：嘉兴学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33