【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，尤其涉及一种黑眶蟾蜍源衍生抗菌肽、制备方法及应用。
技术介绍
1、抗生素的问世使人类攻克了很多细菌性感染疾病。然而随着抗生素的广泛及过渡使用，除了医用抗生素，下水道等生活环境中都含有大量的抗生素，促使细菌产生协同进化，导致越来越多的细菌产生耐药性，“超级细菌”(superbugs)也随之出现。如果再不采取行动，预计2050年全球因“超级细菌”死亡的人数每年会达到1000万人。因此，迫切地需要开发作用方式不同于传统抗菌药物作用机制的新型抗菌药物。
2、抗菌肽(amps)是一类小分子肽。近年来，amps由于其对细菌、病毒、寄生虫等具有广谱的抗菌活性逐渐走进人们的视野。amps广泛存在于自然界中，是天然免疫系统中的重要效应因子。尽管细菌会随着环境进行进化，但是amps也会进行协同进化，这也使抗菌肽的使用具有极大的潜力。多肽的获得有天然产物提取、化学合成和生物合成方法，化学合成方法惯用液相合成和固相合成，成本较高，生物合成方法使用大肠杆菌,枯草芽孢杆菌和毕赤酵母等表达载体，利用蛋白表达生产抗菌肽，存在产量低等问题；天然抗菌肽在生物体内含量极微，提取和纯化十分复杂，且存在原材料耗量大毒性强、稳定性差等问题，不利于开发成为临床药物。抗菌肽cath-dm是从黑眶蟾蜍皮肤组织分离获得的天然抗菌肽，具有37个氨基酸长度，具有广谱抗菌活性，但由于其结构复杂，不利于生产应用。
3、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前多肽获得以固相合成为主，因此越长的氨基酸序列，多肽获得成本越高。此外，由于天然
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种黑眶蟾蜍源衍生抗菌肽、制备方法及应用。
2、本专利技术是这样实现的，一种黑眶蟾蜍源衍生抗菌肽，所述黑眶蟾蜍源衍生抗菌肽包括抗菌肽wk3-nh2、抗菌肽wr3-nh2、抗菌肽ir3-nh2中的任意一种，所述抗菌肽wk3-nh2的氨基酸序列如seq id no：1所示，所述抗菌肽wr3-nh2的氨基酸序列如seq id no：2所示，所述抗菌肽ir3-nh2的氨基酸序列如seq id no：3所示。
3、本专利技术的另一目的在于提供一种黑眶蟾蜍源衍生抗菌肽的制备方法，所述黑眶蟾蜍源衍生抗菌肽的制备方法包括以下步骤：
4、步骤一，截取黑眶蟾蜍源抗菌肽cath-dm中间的15个氨基酸，得到疏水力矩为0.208的一条多肽cath-dm-nct’，氨基酸序列如seq id no：4所示；
5、步骤二，将cath-dm-nct’第1和15位的r、第11位的k用色氨酸(trp,w)进行替换，第9和14位的l用赖氨酸(lys,k)进行替换，并进行c端酰胺化处理；得到疏水力矩为0.836的多肽wk3-nh2，氨基酸序列如seq id no：1所示；
6、步骤三，将cath-dm-nct’第1和15位的r、第11位的k用色氨酸(trp,w)进行替换，第9和14位的l用精氨酸(arg,r)进行替换，并进行c端酰胺化处理；得到疏水力矩为0.837的多肽wr3-nh2，氨基酸序列如seq id no：2所示；
7、步骤四，将cath-dm-nct’第1和15位的r、第11位的k用异亮氨酸(ile,i)进行替换，第9和14位的l用精氨酸(arg,r)进行替换，并进行c端酰胺化处理；得到疏水力矩为0.762的多肽ir3-nh2，氨基酸序列如seq id no：3所示。
8、进一步，衍生抗菌肽wk3-nh2、wr3-nh2、ir3-nh2的分子量分别为2030.54、2086.58、1877.41da，所带电荷均为+6.9；圆二色谱测定wk3-nh2在sds和tfe溶液中二级结构为折叠-无规则结构；wr3-nh2在sds溶液中以折叠和无规则结构为主，在tfe溶液中则以螺旋结构为主；ir3-nh2在sds和tfe溶液以螺旋结构为主。
9、进一步，衍生抗菌肽wk3-nh2、wr3-nh2、ir3-nh2的制备方法步骤如下：根据衍生抗菌肽wk3-nh2、wr3-nh2、ir3-nh2的氨基酸序列，采用固相合成法获得全序列，再利用hplc反相柱层析脱盐即可得到衍生抗菌肽wk3-nh2、wr3-nh2和ir3-nh2，并通过超高效液相色谱-质谱联用分析仪对多肽进行鉴定。
10、本专利技术的另一目的在于提供抗菌肽wk3-nh2、wr3-nh2、ir3-nh2中的任意一种或几种在制备治疗细菌感染性疾病的药物中的应用。
11、进一步，所述药物用于抑制革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。
12、进一步，所述革兰氏阳性细菌包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌。
13、进一步，所述革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌、克氏柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌。
14、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本专利技术所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
15、第一，本专利技术缩短黑眶蟾蜍抗菌肽cath-dm的肽链，并用氨基酸try/ile-arg/lys进行替换，并进行c端酰胺化处理，获得衍生抗菌肽wk3-nh2、wr3-nh2、ir3-nh2。基于上，三种衍生肽保留甚至提高了抗菌活性，且具有较低的溶血活性。此外，该三种衍生抗菌肽在人血清作用下，能明显提高其对大肠杆菌的抗菌活性，使该组多肽具备成为窄谱抗生素替代物的潜力。
16、第二，本专利技术提供的黑眶蟾蜍源衍生抗菌肽的制备方法展示了显著的技术进步。以下是具体的几个方面：
17、1.创新性的抗菌肽设计：传统的抗菌肽来源广泛，但利用黑眶蟾蜍源抗菌肽进行衍生设计，特别是通过对其序列进行精确的修饰和替换，以获得具有更强抗菌活性的肽，是一种创新性的尝试。
18、2.精确的氨基酸替换和修饰：通过对黑眶蟾蜍源抗菌肽cath-dm的特定氨基酸进行精确的替换和修饰，如使用色氨酸(trp,w)、赖氨酸(lys,k)和精氨酸(arg,r)等，实现了对肽的疏水力矩的精确调控。这种调控不仅增强了抗菌肽的抗菌活性，还提高了其稳定性和生物利用度。
19、3.c端酰胺化处理：对肽进行c端酰胺化处理，不仅增加了肽的稳定性，还提高了其在水溶液中的溶解度，从而使其更易于进行后续的药物开发和应用。
20、4.高效的制备方法：整个制备过程简单、高效，易于实现规模化生产。这为后续的药物开发和临床应用提供了便利。
21、5.广泛的应用前景：由于这些抗菌肽具有强大的抗菌活性，因此它们在医药、农业、食品工业等领域具有广泛的应用前景。特别是在对抗抗生素耐药菌方面，这些抗菌肽发挥出重要作用。
22、本专利技术提供的黑眶蟾蜍源衍生抗菌肽的制备方法通过精确调控抗菌肽的氨基酸序列和疏水力矩，实现了对抗菌活性的显著提高，同时简化了制备过程，提高了生产本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种黑眶蟾蜍源衍生抗菌肽，其特征在于，所述黑眶蟾蜍源衍生抗菌肽包括抗菌肽WK3-NH2、抗菌肽WR3-NH2、抗菌肽IR3-NH2中的任意一种，所述抗菌肽WK3-NH2的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，所述抗菌肽WR3-NH2的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示，所述抗菌肽IR3-NH2的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。
2.如权利要求1所述的黑眶蟾蜍源衍生抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述黑眶蟾蜍源衍生抗菌肽的制备方法包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的黑眶蟾蜍源衍生抗菌肽的制备方法，其特征在于，衍生抗菌肽WK3-NH2、WR3-NH2、IR3-NH2的分子量分别为2030.54、2086.58、1877.41Da，所带电荷均为+6.9；圆二色谱测定WK3-NH2在SDS和TFE溶液中二级结构为折叠-无规则结构；WR3-NH2在SDS溶液中以折叠和无规则结构为主，在TFE溶液中则以螺旋结构为主；IR3-NH2在SDS和TFE溶液以螺旋结构为主。
4.如权利要求2所述的黑眶蟾蜍源衍生抗菌肽的制备方法，其特征在于，衍生抗
5.一种如权利要求1所述的抗菌肽WK3-NH2、WR3-NH2、IR3-NH2中的任意一种或几种在制备治疗细菌感染性疾病的药物中的应用。
6.如权利要求5所述的抗菌肽WK3-NH2、WR3-NH2、IR3-NH2中的任意一种或几种在制备治疗细菌感染性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述药物用于抑制革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。
7.如权利要求6所述的抗菌肽WK3-NH2、WR3-NH2、IR3-NH2中的任意一种或几种在制备治疗细菌感染性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述革兰氏阳性细菌包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌。
8.如权利要求6所述的抗菌肽WK3-NH2、WR3-NH2、IR3-NH2中的任意一种或几种在制备治疗细菌感染性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌、克氏柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌。
...【技术特征摘要】
1.一种黑眶蟾蜍源衍生抗菌肽，其特征在于，所述黑眶蟾蜍源衍生抗菌肽包括抗菌肽wk3-nh2、抗菌肽wr3-nh2、抗菌肽ir3-nh2中的任意一种，所述抗菌肽wk3-nh2的氨基酸序列如seq id no：1所示，所述抗菌肽wr3-nh2的氨基酸序列如seq id no：2所示，所述抗菌肽ir3-nh2的氨基酸序列如seq id no：3所示。
2.如权利要求1所述的黑眶蟾蜍源衍生抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述黑眶蟾蜍源衍生抗菌肽的制备方法包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的黑眶蟾蜍源衍生抗菌肽的制备方法，其特征在于，衍生抗菌肽wk3-nh2、wr3-nh2、ir3-nh2的分子量分别为2030.54、2086.58、1877.41da，所带电荷均为+6.9；圆二色谱测定wk3-nh2在sds和tfe溶液中二级结构为折叠-无规则结构；wr3-nh2在sds溶液中以折叠和无规则结构为主，在tfe溶液中则以螺旋结构为主；ir3-nh2在sds和tfe溶液以螺旋结构为主。
4.如权利要求2所述的黑眶蟾蜍源衍生抗菌肽的制备方法，其特征在于，衍生抗菌肽wk3-nh2、wr3-nh2、ir3-nh2的制备方法步...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋玉竹，董詹，罗盈，韩芹芹，张金阳，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：
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