诱导的肝细胞及其用途制造技术

本文公开了来自滋养层干细胞的诱导的肝细胞，用于诱导所述细胞的方法，及其组合物。本文还公开了通过利用本文公开的诱导的肝细胞治疗疾病或病症(例如，与肝相关)的方法。

Induced liver cells and uses thereof

The present invention discloses an induced liver cell derived from a trophoblast stem cell, a method for inducing the cell, and a composition thereof. Also disclosed are methods for treating disease or disease (e.g., liver related) by using an induced liver cell disclosed herein.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】诱导的肝细胞及其用途交叉引用本申请要求2014年11月26日提交的美国临时申请号62/085,185的权益，该申请通过引用以其全文并入本文。援引并入本文公开的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度犹如特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。在本文公开的术语与并入的参考文献中的术语冲突的情况下，以本文的术语为准。
技术实现思路
在很多方面中的一个方面，本文公开了在体外诱导滋养层干(TS)细胞分化为诱导的肝细胞的方法，该方法包括：使滋养层干细胞与条件培养基接触(例如，接触足够的时间)，以诱导滋养层干细胞分化为诱导的肝细胞，其中所述条件培养基包含成纤维细胞生长因子(FGF)、类固醇和细胞因子。在一些实施方案中，本文公开了在体外诱导滋养层干(TS)细胞分化为诱导的肝细胞的方法，该方法包括(a)使滋养层干细胞与包含成纤维细胞生长因子(FGF)、类固醇和细胞因子的条件培养基接触；以及(b)将所述细胞温育足够的时间，以诱导滋养层干细胞分化为诱导的肝细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在将类固醇和细胞因子添加至条件培养基之前，使滋养层干细胞与FGF接触。在一些实施方案中，在将类固醇和细胞因子添加至条件培养基之前，使滋养层干细胞与FGF接触至少2小时、至少4小时、至少6小时、8小时、至少12小时、至少16小时、至少20小时或至少24小时。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将滋养层干细胞温育至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少7天。在一些实施方案中，将类固醇和细胞因子同时或顺序添加至条件培养基中。在一些实施方案中，本文的诱导的肝细胞为肝祖细胞。在一些实施方案中，FGF在TS细胞中上调miRNA-124a。在一些实施方案中，在TS细胞中，miRNA-124a的升高的水平引发定形内胚层(DE)特化(specification)。在一些实施方案中，所述DE特化与包括叉头框蛋白A2(FOXA2)、SRY-box17(SOX17)、Goosecoid(GSC)或同源结构域蛋白MIXL1的生物标志物相关。在一些实施方案中，所述DE特化与SOX17、FOXA2和GSC的升高的表达水平相关。在一些实施方案中，升高的表达水平为增加的蛋白质表达水平。在一些实施方案中，所述DE特化与MIXL1的降低的表达水平相关。在一些实施方案中，降低的表达水平为降低的蛋白质表达水平。在一些实施方案中，SOX17、FOXA2和GSC的升高的蛋白质表达水平以及MIXL1的降低的蛋白质表达水平是相对于未经历DE特化的等同TS细胞中的SOX17、FOXA2、GSC和MIXL1的蛋白质表达水平而言的。在一些实施方案中，所述DE特化进一步与SOX2、NANOG和OCT4的升高的表达水平相关。在一些实施方案中，SOX2、NANOG和OCT4的升高的表达水平为增加的蛋白质表达水平。在一些实施方案中，SOX2、NANOG和OCT4的升高的表达水平为增加的基因表达水平。在一些实施方案中，SOX2、NANOG和OCT4的升高的表达水平是相对于未经历DE特化的等同TS细胞中的SOX2、NANOG和OCT4的表达水平而言的。在一些实施方案中，通过本文的方法诱导的分化包括以下四个阶段中的一个或多个：原条到定形内胚层(DE)阶段、肝特化内胚层阶段、肝母细胞阶段以及胎儿和成人肝细胞阶段。在一些实施方案中，选自CXCR4、FOXA2、SOX17、HHEX、TTR、ALB、TAT、CYP7A1、BSEP、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α、HNF4α及其任意组合的一种或多种生物标志物在所述四个阶段中的一个或多个中表达。在一些实施方案中，选自CXCR4、FOXA2、SOX17、HHEX及其任意组合的一种或多种生物标志物在所述原条到DE阶段表达。在一些实施方案中，相对于在所述原条到DE阶段之前的表达水平，CXCR4、FOXA2、SOX17和/或HHEX的表达水平在所述原条到DE阶段增加。在一些实施方案中，所述增加的表达水平为增加的基因表达水平。在一些实施方案中，相比于在所述原条到DE阶段之前的表达水平，CXCR4、FOXA2、SOX17和/或HHEX的表达水平增加到约1倍至约10,000倍。在一些实施方案中，相比于在所述原条到DE阶段之前的表达水平，CXCR4、FOXA2、SOX17和/或HHEX的表达水平增加到约10倍至约1000倍。在一些实施方案中，选自SOX17、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、CYP7A1及其任意组合的一种或多种生物标志物在所述肝特化内胚层阶段表达。在一些实施方案中，相对于在所述肝特化内胚层阶段之前的表达水平，SOX17、TTR、ALB、TAT、SERPINA1和/或CYP7A1的表达水平在所述肝特化内胚层阶段增加。在一些实施方案中，所述增加的表达水平为增加的基因表达水平。在一些实施方案中，相比于在所述肝特化内胚层阶段之前的表达水平，SOX17、TTR、ALB、TAT、SERPINA1和/或CYP7A1的表达水平增加到约1倍至约1000倍。在一些实施方案中，相比于在所述肝特化内胚层阶段之前的表达水平，SOX17、TTR、ALB、TAT、SERPINA1和/或CYP7A1的表达水平增加到约10倍至约100倍。在一些实施方案中，选自TTR、ALB、TAT、CYP7A1、SERPINA1、BSEP及其任意组合的一种或多种生物标志物在所述肝母细胞阶段表达。在一些实施方案中，相对于在所述肝母细胞阶段之前的表达水平，TTR、ALB、TAT、CYP7A1、SERPINA1和/或BSEP的表达水平在所述肝母细胞阶段增加。在一些实施方案中，所述增加的表达水平为增加的基因表达水平。在一些实施方案中，相比于在所述肝母细胞阶段之前的表达水平，TTR、ALB、TAT、CYP7A1、SERPINA1和/或BSEP的表达水平增加到约1倍至约1000倍。在一些实施方案中，相比于在所述肝母细胞阶段之前的表达水平，TTR、ALB、TAT、CYP7A1、SERPINA1和/或BSEP的表达水平增加到约10倍至约100倍。在一些实施方案中，选自HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α、HNF4α及其任意组合的一种或多种生物标志物在所述胎儿和成人肝细胞样细胞阶段表达。在一些实施方案中，相对于在所述胎儿和成人肝细胞样细胞阶段之前的表达水平，HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α和/或HNF4α的表达水平在所述胎儿和成人肝细胞样细胞阶段增加。在一些实施方案中，所述增加的表达水平为增加的基因表达水平。在一些实施方案中，相比于在所述胎儿和成人肝细胞阶段之前的表达水平，HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α和/或HNF4α的表达水平增加到约10倍至约1000倍。在一些实施方案中，相比于在所述胎儿和成人肝细胞阶段之前的表达水平，HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在体外诱导滋养层干(TS)细胞分化为诱导的肝细胞的方法，该方法包括：使所述滋养层干细胞与条件培养基接触，以诱导所述滋养层干细胞分化为诱导的肝细胞，其中所述条件培养基包含成纤维细胞生长因子(FGF)、类固醇和细胞因子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.26 US 62/085,1851.一种在体外诱导滋养层干(TS)细胞分化为诱导的肝细胞的方法，该方法包括：使所述滋养层干细胞与条件培养基接触，以诱导所述滋养层干细胞分化为诱导的肝细胞，其中所述条件培养基包含成纤维细胞生长因子(FGF)、类固醇和细胞因子。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在将所述类固醇和所述细胞因子添加至所述条件培养基之前使所述滋养层干细胞与所述FGF接触。3.根据权利要求2所述的方法，其中在将所述类固醇和所述细胞因子添加至所述条件培养基之前，使所述滋养层干细胞与所述FGF接触至少2小时、至少4小时、至少6小时、8小时、至少12小时、至少16小时、至少20小时或至少24小时。4.根据任一项前述权利要求所述的方法，其进一步包括将所述滋养层干细胞温育至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少7天。5.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述诱导的肝细胞为肝祖细胞。6.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述分化包括以下四个阶段中的一个或多个：原条到定形内胚层(DE)阶段、肝特异化内胚层阶段、肝母细胞阶段以及胎儿和成人肝细胞阶段。7.根据权利要求6所述的方法，其中选自CXCR4、FOXA2、SOX17、HHEX、TTR、ALB、TAT、CYP7A1、BSEP、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α、HNF4α及其任意组合的一种或多种生物标志物在所述四个阶段中的一个或多个中表达。8.根据权利要求6或7所述的方法，其中选自CXCR4、FOXA2、SOX17、HHEX及其任意组合的一种或多种生物标志物在所述原条到DE阶段表达。9.根据权利要求8所述的方法，其中相对于在所述原条到DE阶段之前的表达水平，CXCR4、FOXA2、SOX17和/或HHEX的表达水平在所述原条到DE阶段增加。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述增加的表达水平为增加的基因表达水平。11.根据权利要求9或10所述的方法，其中相比于在所述原条到DE阶段之前的表达水平，CXCR4、FOXA2、SOX17和/或HHEX的表达水平增加到约1倍至约10,000倍。12.根据权利要求9或10所述的方法，其中相比于在所述原条到DE阶段之前的表达水平，CXCR4、FOXA2、SOX17和/或HHEX的表达水平增加到约10倍至约1000倍。13.根据权利要求6-12中任一项所述的方法，其中选自SOX17、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、CYP7A1及其任意组合的一种或多种生物标志物在所述肝特异化内胚层阶段表达。14.根据权利要求13所述的方法，其中相对于在所述肝特异化内胚层阶段之前的表达水平，SOX17、TTR、ALB、TAT、SERPINA1和/或CYP7A1的表达水平在所述肝特异化内胚层阶段增加。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述增加的表达水平为增加的基因表达水平。16.根据权利要求14或15所述的方法，其中相比于在所述肝特异化内胚层阶段之前的表达水平，SOX17、TTR、ALB、TAT、SERPINA1和/或CYP7A1的表达水平增加到约1倍至约1000倍。17.根据权利要求14或15所述的方法，其中相比于在所述肝特异化内胚层阶段之前的表达水平，SOX17、TTR、ALB、TAT、SERPINA1和/或CYP7A1的表达水平增加到约10倍至约100倍。18.根据权利要求5-17中任一项所述的方法，其中选自TTR、ALB、TAT、CYP7A1、SERPINA1、BSEP及其任意组合的一种或多种生物标志物在所述肝母细胞阶段表达。19.根据权利要求18所述的方法，其中相对于在所述肝母细胞阶段之前的表达水平，TTR、ALB、TAT、CYP7A1、SERPINA1和/或BSEP的表达水平在所述肝母细胞阶段增加。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述增加的表达水平为增加的基因表达水平。21.根据权利要求19或20所述的方法，其中相比于在所述肝母细胞阶段之前的表达水平，TTR、ALB、TAT、CYP7A1、SERPINA1和/或BSEP的表达水平增加到约1倍至约1000倍。22.根据权利要求19或20所述的方法，其中相比于在所述肝母细胞阶段之前的表达水平，TTR、ALB、TAT、CYP7A1、SERPINA1和/或BSEP的表达水平增加到约10倍至约100倍。23.根据权利要求6-22中任一项所述的方法，其中选自HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α、HNF4α及其任意组合的一种或多种生物标志物在所述胎儿和成人肝细胞样细胞阶段表达。24.根据权利要求23所述的方法，其中相对于在所述胎儿和成人肝细胞样细胞阶段之前的表达水平，HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α和/或HNF4α的表达水平在所述胎儿和成人肝细胞样细胞阶段增加。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述增加的表达水平为增加的基因表达水平。26.根据权利要求24或25所述的方法，其中相比于在所述胎儿和成人肝细胞阶段之前的表达水平，HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α和/或HNF4α的表达水平增加到约10倍至约1000倍。27.根据权利要求24或25所述的方法，其中相比于在所述胎儿和成人肝细胞阶段之前的表达水平，HHEX、BSEP、TTR、ALB、TAT、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α和/或HNF4α的表达水平增加到至少100倍。28.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述TS细胞为人TS细胞。29.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述类固醇为地塞米松。30.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述细胞因子为制癌蛋白M。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述制癌蛋白M为人制癌蛋白M。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述人制癌蛋白M为重组人制癌蛋白M。33.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述条件培养基进一步包含骨形态生成蛋白(BMP)。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述BMP以约1-100ng/ml的浓度存在。35.根据权利要求33所述的方法，其中所述BMP以约1-50ng/ml的浓度存在。36.根据权利要求33所述的方法，其中所述BMP以约20ng/ml的浓度存在。37.根据权利要求33-36中任一项所述的方法，其中所述BMP为BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10或BMP15。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述BMP为BMP4。39.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述条件培养基进一步包含肝生长因子(HGF)。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述HGF以约0.1-50ng/ml的浓度存在。41.根据权利要求39所述的方法，其中所述HGF以约0.1-25ng/ml的浓度存在。42.根据权利要求39所述的方法，其中所述HGF以约5ng/ml的浓度存在。43.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述诱导的肝细胞是免疫豁免的。44.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述诱导的肝细胞表达TGFβ1。45.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述诱导的肝细胞在细胞外基质(ECM)中表达TGFβ1、纤连蛋白和胶原IV。46.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述诱导的肝细胞表达HLA-G。47.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述诱导的肝细胞表达HLA-G和stem-121。48.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述诱导的肝细胞募集CD4+Foxp3+Treg细胞。49.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述诱导的肝细胞形成三维结构的组织。50.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述诱导的肝细胞簇集或聚集。51.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述诱导的肝细胞形成新月细胞群。52.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述诱导的肝细胞包含外周室和中央室。53.根据权利要求52所述的方法，其中所述诱导的肝细胞沿着基膜以外的ECM不规则地分布在所述外周室中。54.根据权利要求52或53所述的方法，其中所述诱导的肝细胞在所述中央室中从基底区向中央区分布。55.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述诱导的肝细胞表达选自TGFβ1、HLA-G、stem121、C-kit、CK19、CK18、ALB、α-AFP、β调理素、ADH1、APOF、CPS1、GATA4、CYP1A1、CYP2B6、ASGR1、CXCR4、BSEP、MRP2、Cx32及其任意组合的一种或多种标志物。56.根据权利要求55所述的方法，其中所述诱导的肝细胞表达选自TGFβ1、HLA-G、stem121、C-kit、β调理素、ADH1、APOF、CPS1、CYP2B6、ASGR1、CXCR4、Cx32及其任意组合的一种或多种标志物。57.根据权利要求56所述的方法，其中所述诱导的肝细胞表达选自CPS1、CYP2B6及其组合的一种或多种标志物。58.一种由任一项前述权利要求所述的方法产生的诱导的肝细胞。59.一种衍生自滋养层干细胞的分离的诱导的肝细胞，其中所述肝细胞表达选自下组的一种或多种生物标志物：人白细胞抗原G(HLA-G)、转化生长因子β1(TGFβ1)、分化簇4(CD4)、叉头框P3(Foxp3)、人细胞质标志物stem121(stem121)、肥大细胞/干细胞生长因子受体C-kit(C-kit)、β调理素、载脂蛋白F(APOF)、醇脱氢酶-1(ADH1)、氨基甲酰-磷酸合成酶1(CPS1)、GATA转录因子4(GATA4)、细胞色素P450家族1亚家族A多肽1(CYP1A1)、细胞色素P4502B6(CYP2B6)、脱唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)、C-X-C趋化因子受体4型(CXCR4)、胆汁盐输出泵(BSEP)、多药抗性蛋白-2(MRP2)、连接蛋白32(CX32)、叉头框蛋白A2(FOXA2)、SRY-box17(SOX17)、己糖胺酶A,α多肽(HEXA)、造血表达同源框(HHEX)、运甲状腺素蛋白(TTR)、白蛋白(ALB)、酪氨酸氨基转移酶(TAT)、细胞色素P4507A1(CYP7A1)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白肽酶抑制剂进化枝A(α-1抗蛋白酶、抗胰蛋白酶)成员1(SERPINA1)、ATP-结合盒亚家族C(ABCC2)、CCAAT-增强子-结合蛋白β(C/EBPβ)、肝细胞核因子1-α(HNF1α)、肝细胞核因子4-α(HNF4α)、α-1-胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白8(CK8)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶2线粒体(PCK2)、糖原合成酶2(GYS2)、肝细胞核因子6(HNF6)、醇脱氢酶1C(I类)γ多肽(ADH1C)、细胞色素P4503A4(CYP3A4)、prospero同源框1(PROX1)、色氨酸2,3-双加氧酶(TDO2)、细胞角蛋白18(CK18)以及细胞角蛋白19(CK19)。60.根据任一项前述权利要求所述的肝细胞，其中所述肝细胞为肝祖细胞。61.根据任一项前述权利要求所述的肝细胞，其中所述肝细胞处于以下四个阶段中的一个：原条到定形内胚层(DE)阶段、肝特异化内胚层阶段、肝母细胞阶段以及胎儿和成人肝细胞阶段。62.根据权利要求61所述的肝细胞，其中选自CXCR4、FOXA2、SOX17、HHEX、TTR、ALB、TAT、CYP7A1、BSEP、SERPINA1、G6PC、ABCC2、C/EBPβ、HNF1α、HNF4α及其任意组合的一种或多种生物标志物在所述四个阶段中的一个或多个中表达。63.根据权利要求61或62所述的肝细胞，其中选自CXCR4、FOXA2、SOX17、HHEX及其任意组合的一种或多种生物标志物在所述原条到DE阶段表达。64.根据权利要求63所述的肝细胞，其中相对于在所述原条到DE阶段之前的表达水平，CXCR4、FOXA2、SOX17和/或HHEX的表达水平在所述原条到DE阶段增加。65.根据权利要求64所述的肝细胞，其中所述增加的表达水平为增加的基因表达水平。66.根据权利要求64或65所述的肝细胞，其中相比于在所述原条到DE阶段之前的表达水平，CXCR4、FOXA2、SOX17和/或HHEX的表达水平增加到约1倍至约10,000倍。67.根据权利要求64或65所述的肝细胞，其中相比于在所述原条到DE阶段之前的表达水平，CXCR4、FOXA2、SOX17和/或HH...

【专利技术属性】
技术研发人员：李昭男，李东颖，李育达，蔡英美，
申请(专利权)人：艾克塞利瑞提德生物技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US