能悬浮培养的牛肾细胞及其悬浮培养方法与应用技术

本发明专利技术公开了能悬浮培养的牛肾细胞及其悬浮培养方法与应用。本发明专利技术牛肾细胞MDBK悬浮培养方法省去了细胞消化、换液、频繁分种等大量人工操作，培养方法简便、快速，而且采用反应器培养实现了工艺自动化，不仅提高了单位体积的细胞产量，还解决了传统贴壁培养细胞批间存在差异的技术难题。本发明专利技术的牛肾细胞MDBK及其悬浮培养细胞可用于各类敏感病毒的培养、抗体蛋白生产、疫苗生产、产品外源病毒检验等领域。

Bovine kidney cell capable of suspension culture and suspension culture method and application thereof

The invention discloses a bovine kidney cell capable of suspension culture and a suspension culture method and an application thereof. The invention of bovine kidney MDBK cell suspension culture method without cell digestion, liquid exchange, frequent minutes etc. a large number of manual operations, training method is simple and rapid, and the reactor culture realizes process automation, not only improves the unit volume of the cell yield, but also solves the technical problems of traditional adherent cell number of the differences between. The bovine kidney cell MDBK and the suspension culture cell of the invention can be used for the cultivation of various sensitive viruses, the production of antibody proteins, the production of vaccines, the detection of foreign viruses in products, and the like.

【技术实现步骤摘要】
能悬浮培养的牛肾细胞及其悬浮培养方法与应用
本专利技术属于细胞工程
，特别是涉及可悬浮培养的牛肾细胞(MDBK)悬浮培养后在病毒培养及疫苗生产方面的应用。
技术介绍
牛肾细胞(MDBK)传代细胞系来自公牛肾细胞，可用于病毒培养、原材料检验、营养代谢研究。MDBK通常可采用克氏瓶、转瓶甚至反应器载体培养，但实质均未改变，细胞均为贴壁培养工艺，贴壁培养工艺培养批量较小、批间差异大、生产效率低下、劳动强度大、占用场地多，细胞单位产量低，大规模生产工艺复杂。牛病毒性腹泻/粘膜、牛传染性鼻气管炎、伪狂犬等病毒培养或疫苗生产通常采用MDBK贴壁细胞静置培养或转瓶培养的方法进行扩增，但存在贴壁培养工艺放大繁琐、培养批量较小、批间差异大、生产效率低下、劳动强度大、占用场地多等诸多问题，细胞单位产量低，大规模生产工艺复杂。CN104162154A中提出利用悬浮培养技术生产牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗，其使用经过驯化的MDBK细胞并未形成能够稳定传代的悬浮细胞株，由于细胞悬浮驯化存在不确定因素，并不是每次都能成功复制，在生产应用中存在较大困难。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供可以悬浮培养的牛肾细胞。本专利技术确定的能悬浮培养的牛肾细胞MDBK，具有以下特征：1)细胞直径：14-25μm；2)核型：2n＝60；3)可在不依赖附着物条件下纯悬浮培养；4)使用无血清或低血清培养基培养；或/和5)可使用生物反应器大规模培养。具体的，能悬浮培养的牛肾细胞MDBK为能悬浮培养的牛肾细胞株MDBK-SCGMCCNo.11795。本专利技术另一目的在于提供所述能悬浮培养的牛肾细胞MDBK的筛选方法，是将普通贴壁MDBK细胞经过适应低血清贴壁培养、低血清悬浮培养、无血清悬浮培养等过程，筛选获得能够悬浮培养的MDBK细胞株。该筛选方法中，所述低血清贴壁培养是指：取长满单层的贴壁MDBK细胞，经0.25％(V/V)胰酶消化分散后加入含10％(V/V)新生牛血清的DMEM培养基与低血清培养基(含3％(V/V)新生牛血清的CD培养基)的混合培养基，且混合培养基中低血清培养基混合比例按30％、50％、80％逐部增加，待细胞完全适应混合培养基培养后再增加低血清培养基的含量，最终全部替代为低血清培养基，至细胞生长稳定可连续传代；所述低血清悬浮培养是指：经低血清贴壁培养驯化好的贴壁MDBK细胞，经0.25％(V/V)胰酶消化分散后加入低血清培养基(含3％(V/V)新生牛血清的CD培养基)，稀释细胞至0.5×106细胞/mL，加入三角瓶在37℃恒温摇床100-110rpm培养，富集直至细胞稳定培养；用低血清培养基重悬沉淀细胞并将细胞浓度调节至0.5×106细胞/mL，至37℃恒温摇床100-110rpm培养72h至细胞密度达到1.0×106细胞/mL至可稳定传代，得到初步悬浮MDBK细胞；所述无血清悬浮培养是指：取初步悬浮MDBK细胞，100rpm离心5分钟，弃去上清，加入混合培养基重悬细胞；混合培养基为低血清培养基(含3％(V/V)新生牛血清的CD培养基)与无血清CD培养基的混合物，无血清CD培养基含量为30％，连续培养待细胞可稳定培养后增加混合培养基中无血清CD培养基的含量至50％，连续培养待细胞培养稳定后以无血清CD培养基全部替代低血清培养基，至细胞稳定连续传代；取适应无血清CD培养基培养的悬浮MDBK细胞，将细胞液通过70μm细胞过滤器截留细胞团块，将滤过液100rpm离心5分钟，弃上清，用新鲜CD培养基重悬细胞，调节细胞密度至0.5×106细胞/mL，至37℃恒温摇床100-110rpm培养，重复述步骤直至细胞结团有所减轻，更换为40μm细胞过滤器，重复上述步骤，经过连续处理细胞结团逐步减轻，得到分散良好细胞为筛选获得的能够悬浮培养的MDBK细胞株。本专利技术还一目的在于提供一种牛肾细胞MDBK的悬浮培养方法，是用牛肾细胞专用悬浮培养基将所述牛肾细胞MDBK种细胞悬液稀释至密度为0.3-0.5×106细胞/mL，然后接种至反应器中，加入所述牛肾细胞专用悬浮培养基，在温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm条件下培养48-72小时至反应器内的牛肾细胞MDBK密度达到1.0×106-4.0×106细胞/mL。所述的悬浮培养方法中，所述牛肾细胞专用悬浮培养基为含1％-5％(体积百分比V/V)新生牛血清的CD培养基(低血清培养基)或CD培养基(无血清培养基)；优选牛肾细胞专用悬浮培养基配方为：含CD培养基粉末15-20g/L，碳酸氢钠2-3g/L，pH值7.0-7.2的水溶液；优选CD培养基粉末17.7g/L，使用注射用水溶解后加入碳酸氢钠2.32g/L，调节pH值至7.0-7.2。具体的，所述悬浮培养方法涉及获得所述牛肾细胞MDBK种细胞悬液，包括以下步骤：(1)牛肾细胞MDBK的复苏从液氮中取出一支冻存的权利要求1所述牛肾细胞MDBK或权利要求2所述牛肾细胞MDBK-SCGMCCNo.11795，至37℃-40℃水浴中快速融化，1000rpm离心5min，弃上清液，加入所述牛肾细胞专用悬浮培养基重悬细胞，转至三角摇瓶中，补加培养基，调节细胞密度至0.3-0.5×106细胞/mL，置于摇床中37℃、100rpm悬浮培养；(2)牛肾细胞MDBK的传代细胞培养48-72h后取样计数，若细胞密度≥1.0×106细胞/mL时进行细胞传代，否则继续培养，取能够传代的牛肾细胞MDBK，转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清液(原培养基)，加入新的牛肾细胞专用悬浮培养基重悬细胞，转至三角摇瓶中，补加牛肾细胞专用悬浮培养基，调节细胞密度至0.3-0.5×106细胞/mL，置于摇床中37℃、100rpm悬浮培养1-3代，得到牛肾细胞MDBK种细胞悬液。以上所述悬浮培养方法中，反应器的容积为5L、50L、300L、500L、1000L、或5000L。牛肾细胞MDBK种细胞在反应器中可采用流加培养、批培养或灌注培养等方式进行悬浮培养：所述流加培养方法为：先用牛肾细胞专用悬浮培养基将牛肾细胞MDBK种细胞悬液稀释至密度为0.3-0.5×106细胞/mL，然后将经稀释的牛肾细胞种细胞悬液按反应器容积的20％-40％加入反应器中，在温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm条件下培养，待细胞密度达到≥0.8×106细胞/mL时，开始流加牛肾细胞专用悬浮培养基，流加速度为反应器容积的15％-20％/天，待培养体积达到反应器容积时停止；所述批培养方法为：先用牛肾细胞专用悬浮培养基将牛肾细胞MDBK种细胞悬液稀释至密度为0.3-0.5×106细胞/mL，然后将经稀释的牛肾细胞种细胞悬液按反应器容积的20％-40％加入反应器中，再加入牛肾细胞专用悬浮培养基至反应器容积，在温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm条件下培养，待细胞密度≥1.0×106细胞/mL可停止；所述灌注培养方法为：先用牛肾细胞专用悬浮培养基将牛肾细胞MDBK种细胞悬液稀释至密度为0.3-0.5×106细胞/mL，然后将经稀释的牛肾细胞种细胞悬液加本文档来自技高网...

【技术保护点】
能悬浮培养的牛肾细胞MDBK，具有以下特征：1)细胞直径：14‑25μm；2)核型：2n＝60；3)可在不依赖附着物条件下纯悬浮培养；4)使用无血清或低血清培养基培养；或/和5)可使用生物反应器大规模培养。

【技术特征摘要】
2016.03.16 CN 20161015467121.能悬浮培养的牛肾细胞MDBK，具有以下特征：1)细胞直径：14-25μm；2)核型：2n＝60；3)可在不依赖附着物条件下纯悬浮培养；4)使用无血清或低血清培养基培养；或/和5)可使用生物反应器大规模培养。2.能悬浮培养的牛肾细胞株MDBK-SCGMCCNo.11795。3.获得权利要求1或2所述能悬浮培养的牛肾细胞MDBK的筛选方法，是将普通贴壁MDBK细胞经过适应低血清贴壁培养、低血清悬浮培养、无血清悬浮培养等过程，筛选获得能够悬浮培养的MDBK细胞株。4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述低血清贴壁培养是指：取长满单层的贴壁MDBK细胞，经0.25％(V/V)胰酶消化分散后加入含10％(V/V)新生牛血清的DMEM培养基与低血清培养基(含3％(V/V)新生牛血清的CD培养基)的混合培养基，且混合培养基中低血清培养基混合比例按30％、50％、80％逐部增加，待细胞完全适应混合培养基培养后再增加低血清培养基的含量，最终全部替代为低血清培养基，至细胞生长稳定可连续传代；所述低血清悬浮培养是指：经低血清贴壁培养驯化好的贴壁MDBK细胞，经0.25％(V/V)胰酶消化分散后加入低血清培养基(含3％(V/V)新生牛血清的CD培养基)，稀释细胞至0.5×106细胞/mL，加入三角瓶在37℃恒温摇床100-110rpm培养，富集直至细胞稳定培养；用低血清培养基重悬沉淀细胞并将细胞浓度调节至0.5×106细胞/mL，至37℃恒温摇床100-110rpm培养72h至细胞密度达到1.0×106细胞/mL至可稳定传代，得到初步悬浮MDBK细胞；所述无血清悬浮培养是指：取初步悬浮MDBK细胞，100rpm离心5分钟，弃去上清，加入混合培养基重悬细胞；混合培养基为低血清培养基(含3％(V/V)新生牛血清的CD培养基)与无血清CD培养基的混合物，无血清CD培养基含量为30％，连续培养待细胞可稳定培养后增加混合培养基中无血清CD培养基的含量至50％，连续培养待细胞培养稳定后以无血清CD培养基全部替代低血清培养基，至细胞稳定连续传代；取适应无血清CD培养基培养的悬浮MDBK细胞，将细胞液通过70μm细胞过滤器截留细胞团块，将滤过液100rpm离心5分钟，弃上清，用新鲜CD培养基重悬细胞，调节细胞密度至0.5×106细胞/mL，至37℃恒温摇床100-110rpm培养，重复述步骤直至细胞结团有所减轻，更换为40μm细胞过滤器，重复上述步骤，经过连续处理细胞结团逐步减轻，得到分散良好细胞为筛选获得的能够悬浮培养的MDBK细胞株。5.一种牛肾细胞MDBK的悬浮培养方法，是用牛肾细胞专用悬浮培养基将权利要求1或2所述牛肾细胞MDBK种细胞悬液稀释至密度为0.3-0.5×106细胞/mL，然后接种至反应器中，加入所述牛肾细胞专用悬浮培养基，在温度37℃、溶氧40-60％(饱和度百分比)、pH值7.0-7.2、转速40-60rpm条件下培养48-72小时至反应器内的牛肾细胞MDBK密度达到1.0×106-4.0×106细胞/mL。6.根据权利要求5所述的悬浮培养方法，其特征在于：所述牛肾细胞专用悬浮培养基为含1％-5％(体积百分比V/V)新生牛血清的CD培养基(低血清培养基)或CD培养基(无血清培养基)；优选牛肾细胞专用...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝鹏，刘国英，温谢，孔彩平，纪燕，苍枫，商晓桂，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15