靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞及其应用，用于制备嵌合抗原受体T细胞的嵌合抗原受体包含顺序串联的白介素2信号肽，抗CD19单链抗体，CD8蛋白分子的绞链区，跨膜区，胞内信号结构域及CD3ζ蛋白分子的胞内信号传导结构域；其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。该嵌合抗原受体T细胞应用于制备治疗血液恶性肿瘤的药物或制剂；其中，血液恶性肿瘤包括CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病，弥漫性大B细胞淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。

Chimeric antigen receptor T cells targeting CD19 and its application

The invention discloses a targeting CD19 chimeric antigen receptor in T cells and its application for the preparation of chimeric antigen receptor chimeric antigen receptor T cells contain series interleukin 2 signal peptide, anti CD19 antibody, CD8 protein molecular hinge region, transmembrane domain, signal transduction of intracellular signals domain CD3 and zeta protein molecules within the cell; its amino acid sequence is shown as SEQ ID NO:9. The chimeric antigen receptor T cell is applied in the preparation of drugs or preparations for treating hematological malignancies, including hematological malignancies including CD19 positive acute B lymphoblastic leukemia, diffuse large B cell lymphoma and non Hodge's lymphoma.

【技术实现步骤摘要】
靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞及其应用
本专利技术属于免疫学和分子生物学
，具体涉及一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞及其应用。
技术介绍
传统的放、化疗、手术、造血干细胞移植等治疗方法延长了部分血液系统恶性肿瘤患者的生存时间，但是复发、难治甚至耐药现象，仍是目前面临的巨大挑战。近年来，细胞免疫治疗因在肿瘤的肿瘤中取得了突破性进展，成为血液系统等多种肿瘤治疗的重要手段，被Science杂志列为2013年十大科学突破的首位。其中嵌合抗原受体T细胞免疫治疗进展尤为突出。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)免疫治疗技术是在体外通过基因工程技术修饰患者自体或异体T细胞成为表达嵌合抗原受体的嵌合抗原受体T细胞。嵌合抗原受体分子中包括一个能特异地识别癌细胞表面抗原蛋白的单链抗体(scFv)，嵌合抗原受体中的scFv赋予了嵌合抗原受体T细胞特异地识别癌细胞的能力，当回输到病人体内后嵌合抗原受体T细胞就能特异性地杀死肿瘤细胞。嵌合抗原受体T细胞免疫治疗具有特异性强，安全性高，能长期有效控制甚至完全治愈肿瘤，是肿瘤治疗技术的重大突破。CD19特异性表达于恶性和正常B细胞以及B细胞前体细胞，而造血干细胞及非造血细胞则不存在CD19表达，因此针对CD19的嵌合抗原蛋白T细胞能特异地杀伤表达CD19恶性B细胞肿瘤。过继性免疫细胞治疗(adoptiveT-celltherapy，ACT)通过回输自体或经肿瘤特异性诱导的T细胞，在治疗一些到目前为止用其它手段几乎难以治愈的转移性恶性肿瘤如黑色素瘤方面取得重大成功；但由于回输T细胞在体内活性持续较短、缺乏肿瘤特异性及疗效不确切等诸多问题，在临床应用上受到限制。针对过继性细胞治疗中回输T细胞的这些不足，本专利技术旨在设计一种人工的嵌合抗原受体蛋白，并利用基因工程技术在体外对患者自体的T细胞进行修饰，使设计的嵌合抗原受体蛋白表达在细胞膜上，使之成为嵌合抗原受体T细胞；当嵌合抗原受体T细胞回输到患者体内后，嵌合抗原受体利用其位于细胞表面的单链抗体部分识别并结合位于肿瘤细胞表面的特异抗原，这种特异性地结合改变嵌合抗原受体位于T细胞内的信号释放区的构象，信号释放区就会发出刺激信号来激活T细胞对肿瘤细胞的杀伤机制，从而杀死肿瘤细胞；同时嵌合抗原受体信号释放区发出的刺激信号还会刺激T细胞生长，产生更多的嵌合抗原受体T细胞，直至杀死所有的肿瘤细胞。
技术实现思路
针对上述现有技术中的不足，本专利技术提供了一种能够特异性地抑制、杀伤CD19恶性B细胞肿瘤的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞及其应用。为实现上述目的，本专利技术首先提供了一种用于制备靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的嵌合抗原受体，具体采用了以下技术方案：一种靶向CD19的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含顺序串联的白介素2信号肽，抗CD19单链抗体，CD8蛋白分子的绞链区，跨膜区，胞内信号结构域及CD3ζ蛋白分子的胞内信号传导结构域；其氨基酸序列如SEQIDNO:9所示。优选的，在嵌合抗原受体T细胞外表面、能识别肿瘤细胞表面CD19抗原的是鼠源的抗CD19单链抗体(克隆号FMC63)，所述抗CD19单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，轻重链之间的连接区的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；所述嵌合抗原受体在其N-端以白介素2的信号肽跟抗CD19的单链抗体的重链可变区连接，其中白介素2信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。优选的，所述嵌合抗原受体中的抗CD19单链抗体通过CD8蛋白分子的铰链区与跨膜区相连接；该铰链区的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。优选的，所述胞内信号传导结构域(或者信号共刺激区)与跨膜区来自同一信号蛋白分子，所述的信号蛋白分子选自CD27、CD28、人肿瘤坏死因子受体9、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或者与CD83特异性结合的配体。进一步的，所述嵌合抗原受体的跨膜区跟胞内信号结构域选自人肿瘤坏死因子受体9；该人肿瘤坏死因子受体9蛋白分子的跨膜区氨基酸序列如SEQIDNO:6所示；该人肿瘤坏死因子受体9蛋白分子的胞内信号传导结构域氨基酸序列如SEQIDNO:7所示。优选的，所述CD3ζ蛋白分子的胞内信号传导结构域或者(刺激信号释放区)其氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。本专利技术还提供了一种核酸分子，其编码上述的嵌合抗原受体，且其核苷酸序列如SEQIDNO:10所示。本专利技术还提供了一种载体，其包括上述的核酸分子；所述载体是利用所述核酸分子对慢病毒载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE中的GFP基因进行取代，并且以人延长因子1α基因的启动子取代其中的PGK启动子；其核苷酸如SEQIDNO:11所示。本专利技术还提供了一种T细胞，其表达权利要求1至6任一项所述的嵌合抗原受体。本专利技术还提供了上述T细胞的用途，具体应用于制备治疗血液恶性肿瘤的药物或制剂；其中，所述的血液恶性肿瘤包括CD19阳性的急性B淋巴细胞白血病，弥漫性大B细胞淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。优选的，所述治疗血液恶性肿瘤的药物或制剂包括表达所述嵌合抗原受体的患者自体免疫细胞。进一步地，所述治疗血液恶性肿瘤的药物或制剂包括表达所述嵌合抗原受体的患者自体NK细胞和CD3阳性T细胞。本专利技术的有益效果在于：CD19特异性表达于恶性和正常B细胞以及B细胞前体细胞，而造血干细胞及非造血细胞则不存在CD19表达，因此针对CD19的嵌合抗原受体T细胞能特异地杀伤表达CD19恶性B细胞肿瘤。本专利技术依据该思路，利用基因工程技术在体外对患者自体的T细胞进行修饰，使设计的嵌合抗原受体蛋白表达在细胞膜上，使之成为嵌合抗原受体T细胞；并且经过试验证明，本专利技术提供的嵌合抗原受体T细胞具有抑制肿瘤细胞增殖、调节机体的免疫防御机制限制肿瘤的生长、特异性杀伤CD19阳性肿瘤细胞的优势，可应用于肿瘤的治疗。附图说明图1为本专利技术嵌合抗原受体T细胞与对照T-细胞的流式细胞检测结果对比图。图2为本专利技术嵌合抗原受体T细胞与正常T细胞的体外试验结果对照图。图3为本专利技术嵌合抗原受体T细胞与正常T细胞受刺激分泌INF-γ的试验结果对照图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例对本专利技术中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。【实施例1】表达针对CD19的嵌合抗原受体基因的嵌合抗原受体慢病毒载体的构建(1)全部人工合成的编码嵌合抗原受体的人工CAR基因(包括人伸长因子1α基因的启动子，并在5’-端加EcoRV内切酶位点，在3’-端加SalI内切酶位点)。(2)用EcoRV和SalI(NEB公司)双酶切从慢病毒载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE中切除GFP基因和PGK启动子，将包含人伸长因子1α基因的启动子的人工合成的编码嵌合抗原受体的人工CAR基因取代GFP基因和PGK启动子，从而得到能表达针对CD19的嵌合抗原受体基因的嵌合抗原受体慢病毒载体。【实施例2】使用三载体系统在293T细胞中包装包含编码嵌合抗原受体的人工基因的重组载体的假慢本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体包含顺序串联的白介素2信号肽，抗CD19单链抗体，CD8蛋白分子的绞链区，跨膜区，胞内信号结构域和CD3ζ蛋白分子的胞内信号传导结构域；其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

【技术特征摘要】
1.一种靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体包含顺序串联的白介素2信号肽，抗CD19单链抗体，CD8蛋白分子的绞链区，跨膜区，胞内信号结构域和CD3ζ蛋白分子的胞内信号传导结构域；其氨基酸序列如SEQIDNO:9所示。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述抗CD19单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，轻重链之间的连接区的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示；所述嵌合抗原受体在其N-端以白介素2的信号肽跟抗CD19单链抗体的重链可变区连接，白介素2信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述CD8蛋白分子铰链区的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述胞内信号结构域与跨膜区来自同一信号蛋白分子，所述的信号蛋白分子选自CD27、CD28、人肿瘤坏死因子受体9、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3...

【专利技术属性】
技术研发人员：史燕东，武宁，
申请(专利权)人：英普乐孚生物技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31