用于制备DC疫苗的多肽片段及DC疫苗制造技术

本发明专利技术公开了用于制备DC疫苗的多肽片段及DC疫苗。所述多肽片段选自如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.6所示的至少其一的氨基酸序列。一种DC疫苗，该DC疫苗包含负载多肽片段的DC细胞。具体地，所述DC疫苗的组成为：负载所述多肽片段的DC细胞、人血白蛋白、生理盐水；其中，人血白蛋白在生理盐水中的质量浓度为5％‑20％，负载多肽片段的DC细胞的密度是(0.5‑2)*10

【技术实现步骤摘要】
用于制备DC疫苗的多肽片段及DC疫苗
本专利技术属于生物疫苗
，具体涉及用于制备DC疫苗的多肽片段及DC疫苗。
技术介绍
乳腺癌发病率位居全球女性恶性肿瘤的第一位，严重危害女性健康；在中国，女性乳腺癌的发病率也呈逐年上升趋势。随着早期诊断和综合治疗的开展，乳腺癌的病死率已经逐渐下降。尽管如此，仍有较多患者会发生转移和复发。1890年，纽约骨外科医生WilliamColey在做手术切除肿瘤的时候发现，术后感染的病人比没有感染的病人恢复的要更好，主要由于感染提高了机体免疫力，继而提高了免疫细胞识别和杀伤肿瘤细胞的能力，这一发现为肿瘤治疗提出了新的思路。2013年，肿瘤免疫治疗由于其卓越的疗效和创新性，被《科学》杂志评为年度最重要的科学突破。现在肿瘤免疫治疗已经成为与手术，化疗，放疗并行的重要治疗手段。根据靶点特异性可以将肿瘤免疫细胞治疗技术分为两类：1.以CIK，NK为代表的非特异性免疫治疗，这类技术不局限于特定的靶点，对于多种肿瘤细胞均有一定的杀伤作用，但是杀伤作用较弱，很难完全消除肿瘤组织，可以用于肿瘤预防，与其他治疗手段联合使用可以提高患者的生存质量，减少肿瘤的复发及转移。2.以DC疫苗，CAR-T为代表的特异性肿瘤免疫治疗，该策略靶向了特定的肿瘤抗原，并能发挥强大的杀伤作用，以CAR-T技术为例，靶向CD19的CAR-T目前用于急性淋巴细胞白血病的治疗完全缓解率可以达到80％以上，但是由于作用靶点单一，往往不能对异质性的肿瘤组织进行彻底的杀伤。因此CAR-T目前在实体瘤治疗效果上受限。与使用T细胞不同，树突细胞属于抗原递呈细胞，具有强大的免疫调理作用，在体内不仅可以通过免疫突触激活特异性的T细胞克隆，还可以通过分泌的细胞因子，趋化因子等募集并激活其他的免疫细胞，对肿瘤组织进行杀伤。2010年美国FDA批准上市的首个癌症治疗疫苗PROVENGE就是基于DC细胞开发的晚期前列腺癌的治疗型疫苗，可将晚期前列腺患者的总生存期延长4.1个月。根据抗原负载的方式可以将DC疫苗分为多肽疫苗和基因疫苗。多肽疫苗是直接将抗原片段与DC细胞表面的抗原递呈分子结合并在体内形成免疫突触的方式激活体内特异性的T细胞，与DNA疫苗相比，不需要克服DC细胞难以导入外源基因的技术壁垒，且在减少转染操作步骤的同时提高DC细胞的存活率。目前有专利报道的用于乳腺癌治疗的DC多肽疫苗主要靶向HER-2蛋白，与赫赛汀等靶向治疗药物相同，但是仅有20～30％的乳腺癌细胞表达HER-2蛋白，因此对于其余的70～80％的肿瘤细胞并没有直接的杀伤效果。申请号为200910043974.7的专利报道了一种新的HER2/neu基因改造的树突细胞疫苗，属于DC细胞基因疫苗，专利中将表达HER2/neu的基因片段构建到表达载体上，通过病毒将HER2/neu基因转染到DC细胞中，基因在细胞内表达出目的蛋白，在细胞内降解成多肽片段后，通过MHC分子递呈到细胞表面，以此来激活体内的T细胞对表达HER2的肿瘤细胞进行杀伤。该疫苗适用于HER2阳性乳腺癌的治疗。由于仅有20～30％的乳腺癌细胞表达HER-2蛋白，因此靶向HER2的DC疫苗对于乳腺癌细胞的杀伤效果有限。研究中采用重组病毒为载体将基因导入DC细胞中，由于这种基因转入方式是将目的片段随机整合到基因组DNA中的，因此应用过程中存在一定的成瘤性的风险。DC细胞属于难转染细胞，往往需要多次转染才能达到理想的转染效果，且慢病毒生产成本高，因此提高了DC疫苗的生产成本。申请号为200580052507.0的专利报道了由肿瘤抗原衍生的优化隐蔽性肽组成的免疫原性多肽及其用途，属于DC细胞多肽疫苗，专利中选择三种肿瘤普遍高表达的抗原TERT，MUC-1，HER-2，根据HLA-A0201表型进行了多肽的设计和筛选，将三种有效的多肽片段通过氨基酸连接或直接混合的方式组和在一起，负载在DC细胞上后激活CD8+CTL细胞发挥肿瘤杀伤的作用。专利中选择的三种抗原均为肿瘤相关抗原，除了在肿瘤组织高表达外，在正常组织中也有普遍表达，因此会导致CTL细胞攻击正常组织而导致一定的安全问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是，提供一种用于制备DC疫苗的多肽片段及DC疫苗，解决现有技术中DC疫苗安全性低、生产成本高的技术问题。本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：用于制备DC疫苗的多肽片段，所述多肽片段选自如SEQIDNO.1-SEQIDNO.6所示的至少其一的氨基酸序列。优选地，所述多肽片段由化学法进行合成，多肽纯度大于95％。优选地，所述多肽片段来自于人乳腺珠蛋白的氨基酸序列。优选地，所述多肽片段获得方式为，在线预测人乳腺珠蛋白中不同多肽片段与MHC类分子HLA-A0201的亲和力数据，选取其中亲和力高的片段为所述多肽片段。在线预测的网址为https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/；网站会对测试的多肽片段给出评分，按照评分情况及多肽片段的位置选择需要的多肽。本专利技术通过对评分高的多肽逐一进行结合实验筛选，SEQIDNO.1-SEQIDNO.6所示的多肽片段是筛选后阳性的多肽片段，阴性的多肽片段未在本专利中列出。本专利技术还提供一种DC疫苗，该DC疫苗包含负载SEQIDNO.1-SEQIDNO.6所示多肽片段的DC细胞。优选地，所述DC疫苗的组成为：负载多肽片段的DC细胞、人血白蛋白、生理盐水；其中，人血白蛋白在生理盐水中的质量浓度为5％-20％，负载多肽片段的DC细胞的密度是(0.5-2)*106个/mL。优选地，所述DC疫苗是通过将DC细胞与所述多肽片段共培养获得。本专利技术还提供所述的DC疫苗的制备方法，该方法为：步骤1，DC细胞的分离与诱导：血液样品或单采机收集到的白细胞，用淋巴细胞分离液分离出外周血单核细胞，通过贴壁培养分离出单核细胞后，用含有GM-CSF、IL-4、自体血浆的淋巴细胞培养基培养并诱导单核细胞向DC细胞分化；步骤2，多肽的负载：诱导培养4-6天后，向培养体系中加入权利要求1所述的多肽片段，可单独加入一种序列的多肽片段或者几种多肽片段的混合物，所加入多肽片段的浓度为1-100μg/mL，37℃条件下共培养得到负载有多肽片段的DC细胞；步骤3，制备DC疫苗制剂：向负载有多肽片段的DC细胞中加入10-30ng/mLTNF-α，促进DC细胞的成熟，DC细胞培养成熟后，离心收集细胞，用生理盐水洗涤细胞，最后将负载有多肽片段的DC细胞悬浮于含3-6％(质量体积比)人血白蛋白的生理盐水中，负载多肽片段的DC细胞的悬浮密度是(0.5-2)*106个/mL，制得DC疫苗制剂。优选地，所述步骤2中多肽片段的浓度为5-50μg/mL。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：1，本专利技术选择人乳腺珠蛋白为攻击靶点，通过计算机设计和实验筛选得到有效的多肽片段用于制备的DC多肽疫苗可以用于HER2阳/阴性乳腺癌患者的治疗，并对复发和转移起到预防作用。2，本专利技术的DC疫苗具有较高的安全性。人乳腺珠蛋白具有组织特异性，仅表达于乳腺组织中，因此如同靶向CD19CAR-T，即便激活的T细胞对表达靶分子的正常细胞进行攻击，也仅仅对乳腺组织进行破坏，而不会攻击到其他组织，因此不会危及到患者的生命。多肽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于制备DC疫苗的多肽片段，其特征在于：所述多肽片段选自如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.6所示的至少其一的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.用于制备DC疫苗的多肽片段，其特征在于：所述多肽片段选自如SEQIDNO.1-SEQIDNO.6所示的至少其一的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的用于制备DC疫苗的多肽片段，其特征在于：所述多肽片段由化学法合成，多肽纯度大于95％。3.如权利要求1所述的用于制备DC疫苗的多肽片段，其特征在于：所述多肽片段来自于人乳腺珠蛋白的氨基酸序列。4.如权利要求1所述的用于制备DC疫苗的多肽片段，其特征在于：所述多肽片段获得方式为，在线预测人乳腺珠蛋白中不同多肽片段与MHC类分子HLA-A0201的亲和力数据，选取其中亲和力高的片段为所述多肽片段。5.一种DC疫苗，该DC疫苗包含负载权利要求1所述多肽片段的DC细胞。6.如权利要求5所述的一种DC疫苗，其特征在于，该DC疫苗的组成为：负载权利要求1所述多肽片段的DC细胞、人血白蛋白、生理盐水；其中，人血白蛋白在生理盐水中的质量浓度为5％-20％，负载多肽片段的DC细胞的密度是(0.5-2)*106个/mL。7.如权利要求5所述的一种DC疫苗，其特征在于：所述DC疫苗是通过将DC细胞与权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊青卉，武宁，韩德平，谢羽，孙全霞，
申请(专利权)人：英普乐孚生物技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31