突变体的高通量测序筛选方法技术

本发明专利技术属于在分子生物学技术领域，一种突变体的高通量测序筛选方法，其特征在于，包括：分离诱变群体每个成员的基因组DNA；集合所获得的DNA；使用高通量测序测定扩增产物的核苷酸序列；用一对引物从DNA集合中扩增目标序列的部分；通过聚类/联配片段的序列鉴定突变的序列；根据确定的突变序列鉴定具有突变的成员。可以在计算机中评定突变对基因功能的影响，意味着选择活性突变。可以选择仅产生沉默替换的突变，提高效率。该方法进一步避免了使用CELI消化、异源双链形成和繁琐的凝胶评分。因此，该发明专利技术对CELI技术伴随的集合限制是不敏感的。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】
本专利技术属于在分子生物学
，本专利技术涉及使用高通量测序技术用于鉴定微生物突变体。
技术介绍
在现代基因组研究中利用携带有突变的群体，通过逆向遗传方法，来鉴定影响重要性状的基因。这对于植物和农作物，以及其它有机体均是有用的。诱变群体常被用于筛选已知的功能缺失突变基因，或评价因突变基因造成的有机体的表型变化。下面详细的描述了这个群体和筛选方法的原理，并且描述了更有效的筛选方法，该方法增强了这些基因发现工具的价值。逆向遗传学 “逆向遗传学”主要鉴定一个感兴趣的基因，然后确认该基因是否影响感兴趣的特定的表型特征。正向遗传学 培养植物诱变群体并表现出感兴趣性状的表型。随后，带有感兴趣表型的植物和野生型杂交来异型杂交掉和感兴趣的表型没有联系的突变。最后，利用定位克隆确认对于感兴趣的表型的突变基因(使用遗传标志物)，类似于常规对种群进行遗传做图的QTL做图。虽然理论上是可能的，但是诱变群体通常不用于此方面。
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开一种，筛选大规模群体是否存在突变以及增加鉴定影响基因功能的突变的效率，即，减少耗费在筛选不会导致基因功能改变的突变中的工作量。为此，本专利技术给出的技术方案为: 一种，其特征在于，包括: 分离诱变群体每个成员的基因组DNA; 集合所获得的DNA ； 使用高通量测序测定扩增产物的核苷酸序列； 用一对引物从DNA集合中扩增目标序列的部分； 通过聚类/联配片段的序列鉴定突变的序列； 根据确定的突变序列鉴定具有突变的成员。所述引物是加标签的，“加标签”指的是为了能够和第二个或更多的核酸进行区分，向核酸中加入标签或标记；例如:在扩增过程中使用带标签引物或本领域任意其它已知方法加入序列标识符来加标签，这种序列标识符可以是一种具有不同的但是确定长度的独特的碱基序列，专门用于辨识特定核酸样品。其中高通量测序通过合成来进行，其中测序包括步骤: (i)将测序接头连接到片段上； (?)将所述接头——连接片段退火到小珠上，每个小珠退火一个片段； (iii)在油中水微反应器中乳化小珠，使得每个微反应器含有一个小珠； (iv)进行乳化PCR来扩增小珠表面上的接头——连接片段(V)选择/富集连接有所述的扩增的接头——连接片段的小珠(vi)将小珠置于孔中，使得每个孔包含一个小珠；和 (vii)产生焦磷酸信号。与现有技术相比，上述技术方案具有的有益效果是:本专利技术的方法的优点尤其是，可以在计算机中评定突变对基因功能的影响，意味着选择活性突变。可以选择仅产生沉默替换的突变，提高效率。该方法进一步避免了使用CEL I消化、异源双链形成和繁琐的凝胶评分。因此，该专利技术对CEL I技术伴随的集合限制是不敏感的。【具体实施方式】以下结合实施例对本专利技术技术方案做进一步说明。本实施例中采用的本领域的常规方法分离DNA，例如从群体成员中收集组织、提取DNA(例如使用Q-B1gene fast DNA试剂盒)、定量并标准化来获得每种样品的等量的DNA。作为范例，本专利技术基于3072个植物的TILLING群体和一个1500bp的基因进行了举例说明。当库中的PCR产物长度超过测序(sequence trace)的平均长度时,扩增产物可以被随机片段化随后再对片段测序。能利用物理技术实现片段化，即，剪切、超声处理或其它随机片段化方法。实施例1 在一个优选的实施方案中，测序包括步骤: (a)使加接头的片段退火到小珠上，每个小珠上退火有单一的加接头片段； (b)在油中水微型反应器中乳化小珠，每个油中水微型反应器中包含单一的一个小珠; (c)将小珠装填到小孔中，每个孔包含一个小珠；以及产生焦磷酸盐信号。在第一步(a)中，测序接头被连接到库中的片段上。测序接头包括至少一个用于退火到小珠上的“关键”区域，一个测序引物区域和一个PCR引物区域。因此获得了加接头的片段。在第二步中，加接头的片段被退火到小珠上，每个小珠退火有单一的一个加接头片段。在加接头片段的集合中过量加入小珠来确保对于大多数小珠(泊松分布)来说每个小珠退火单一的一个加接头片段。在下一步中，在油中水微型反应器中乳化小珠，每个油中水微型反应器中包含单一的一个小珠。在油中水微型反应器中存在PCR试剂，能在微型反应器中进行PCR反应。随后，破坏微型反应器，富集包含DNA的小珠(DNA阳性珠)。在下一步中，将小珠装填到小孔中，每个孔包含单一的一个小珠。优选的，这些小孔是能用于大量片段同时测序的PicoTiter Plate的部分。在加入携带有酶的小珠后，使用焦磷酸测序(pyrosequencing)测定片段的序列。在后续步骤中，向PicoTiter Plate和小珠以及其中的酶珠中加入不同的脱氧核糖核苷酸以及常规的测序试剂，当脱氧核糖核酸掺入时产生光信号并被记录。正确的核苷酸的掺入将产生焦磷酸测序能被检测到的信号。通过聚类扩增库中的已测序片段来确定突变。通过排列比对库中片段的已确定序列确定突变。大部分的序列是野生型的(未突变的)，但是也观察到诱导突变和偶然发生的测序错误。因为通过多倍冗余(典型的大约为4到5倍冗余)测序扩增库，多次观察到相同的序列改变表明是一个突变，而不是测序错误。聚类提供了扩增库的排列比对(alignment)。对于库中的每个PCR产物以这当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种突变体的高通量测序筛选方法，其特征在于，包括：分离诱变群体每个成员的基因组DNA；集合所获得的DNA；使用高通量测序测定扩增产物的核苷酸序列；用一对引物从DNA集合中扩增目标序列的部分；通过聚类/联配片段的序列鉴定突变的序列；根据确定的突变序列鉴定具有突变的成员。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张艺，马丰收，梁建伟，严冰冰，
申请(专利权)人：晶能生物技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31