口服独一味后大鼠血浆中胡麻属苷含量的测定方法技术

本发明专利技术涉及医药学检测技术领域，特别是中成药体内代谢研究技术领域，具体是一种口服独一味后大鼠血浆中胡麻属苷成分的确定及其含量测定方法，含量测定方法是采用高效液相色谱质谱联用检测方法，在所建立的检测方法下对口服独一味后大鼠血浆中胡麻属苷成分进行含量测定。本发明专利技术含量测定方法的精密度高，重现性佳，稳定性好，测定结果准确可靠，可有效评价独一味中的胡麻属苷在生物体内的药动学过程。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药学检测
，特别是中成药体内代谢研究
，具体地说，是口服独一味后大鼠血浆中胡麻属苷的鉴定及含量测定方法。
技术介绍
独一味是中国传统中药，其植物全草收录于《中国药典》2005版，其地上部分收录于《中国药典》2010版，具有活血化瘀、消肿止痛的作用。用于术后的刀口疼痛、出血、骨质疏松、风湿及血瘀肿胀等症状，在止血和凝血方面具有确切的疗效。根据文献报道，独一味的主要生物活性成分是环烯醚萜类、黄酮类和苯乙醇苷类化合物。2005版《中国药典》中指标成分为木犀草素，药用部位为全草，即地上部分和根、根茎部分；2010版《中国药典》中指标成分变更为山栀苷甲酯和8-乙酰山栀苷乙酯，药用部位为地上部分。指标成分和入药部位的变更论证尚属空白，且2010版《中国药典》未提及同样具有药理活性的环烯醚萜苷类化合物。为明确其有效成分在体内的代谢过程，必须建立一套对服用独一味后血浆中活性成分的浓度进行监测的方法，为独一味的后续研究工作提供可靠依据。通过文献调研发现，目前对于独一味中的主要生物活性成分研究已经比较清楚，且随着中药领域技术的发展，中药成分药代动力学参数的重要性日益显现，但是仅有一篇报道独一味所含4种环烯醚萜类化合物在生物体内的代谢过程，阐明其浓度随时间的变化情况(P.C.Fan,M.X.Li,H.P.Ma,L.L.Jing,J.G.Qiu,Z.P.Jia,Simultaneousdeterminationoffourshanzhisidemethylesterderivativesinrabbitplasmabyliquidchromatography/tandemmassspectrometry.Biomed.Chromatogr.26(2012)1543-1551.)，该方法是在正离子模式下将[M+Na]+峰作为母离子进行检测，但[M+Na]+峰结合一般较稳定，较难以裂解形成子离子。潘正等公开了采用高效液相色谱法测定独一味根中胡麻属苷等6种化学成分的方法(潘正,高运玲,张涛,邓杰.HPLC法测定独一味根中环烯醚萜苷和苯乙醇苷[J].中草药,2011,42(2):279-281.)，但采用此方法无法检测服药后血浆中胡麻属苷的含量。目前关于一种口服独一味后大鼠血浆中胡麻属苷成分的确定及其含量测定方法还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种口服独一味后大鼠血浆中药物成分的确定及其含量测定方法。为了对独一味开展药动学研究，本专利技术对比了大鼠服用独一味药材地上部分和全草后血浆所含药物成分的种类差别，并且建立大鼠血浆中胡麻属苷的含量测定方法。独一味进入体内后，血液中主要存在环烯醚萜类、苯乙醇苷类、黄酮类、糖类化合物，包括原型及其代谢产物，其数量众多，结构类似，对各物质的定量检测带来了较大的难度。技术方案：(1)采用液质联用技术(LC-MS)确定胡麻属苷和替硝唑对照品的质谱条件；(2)优化色谱条件，使对照品溶液中胡麻属苷和替硝唑达到基线分离；(3)以替硝唑为内标，测定大鼠血浆中胡麻属苷的含量。具体步骤如下：①选取替硝唑为本次实验的内标。②胡麻属苷和替硝唑对照品质谱检测条件：胡麻属苷465.2→257.2，替硝唑246.0→125.9。③液相色谱分离条件：Agilent1200HPLC液相色谱仪，反相色谱柱，柱温为35℃，流动相为：酸性乙腈(A)和酸性水(B)，流速为0.4mL/min，进样体积为10μL，梯度洗脱，检测时间为5min。后运行时间为5min。④LC-MS参数：Agilent6410QQQ质谱系统，离子化方式为电喷雾条件，采用负离子条件下MRM模式，内标为替硝唑，干燥气流速为10L/min，干燥气温度为350℃，雾化气压力为40psi，毛细管电压为4000V。⑤基于LC-MS系统，采用内标法对独一味中胡麻属苷进行含量测定。⑥方法学验证：仔细考察测试方法的基质效应、提取回收率、精密度和稳定性。本专利技术的目的是通过如下方案实现的：本专利技术具体提供了一种口服独一味后大鼠血浆中胡麻属苷含量的测定方法，包括以下步骤：(a)血浆的处理：取0.1mL大鼠血浆置于1.5mLEP管中，加入0.3mL甲醇溶液(含0.1％甲酸(v/v)和200ng/mL替硝唑内标)，涡旋混匀3min，再以13000rpm离心10min，取上清液0.2mL，于37℃氮气流吹干，再以0.4mL初始流动相(酸性乙腈和酸性水，8:92，v/v)复溶，取10μL作为血浆测试样品；(b)精密吸取步骤(a)得到的血浆测试样品注入高效液相色谱-质谱联用仪，内标法定量，测得血浆中胡麻属苷的含量；其中，液相条件为：Agilent1200HPLC液相色谱仪，反相色谱柱，柱温为35℃，流动相为：酸性乙腈和酸性水，流速为0.4mL/min，进样体积为10μL，梯度洗脱，检测时间为5min；后运行时间为5min；所述的酸性乙腈和酸性水中，加入的酸均为甲酸，浓度为0.1％(v/v)；所述的反相色谱柱为AgilentZorbaxSB-C18色谱柱，具体规格为2.1mm×100mm，填料为3.5μm。所述的梯度洗脱过程为：8-40％有机相酸性乙腈A(0-1min)，40-95％有机相酸性乙腈A(1-4min)，95％有机相酸性乙腈A(4-5min)。质谱条件为：Agilent6410QQQ质谱系统，离子化方式为电喷雾条件，采用负离子条件下MRM模式，内标为替硝唑，干燥气流速为10L/min，干燥气温度为350℃，雾化气压力为40psi，毛细管电压为4000V。所述的质谱检测为多反应监测模式，反应离子对分别为：胡麻属苷465.2→257.2，替硝唑246.0→125.9。所述的大鼠血浆的制备方法包括以下步骤：(a)将独一味地上部分或全草加入4-5倍体积的50％乙醇水溶液(v/v)提取3次，每次30min，得独一味的提取物。所得提取物溶于适量0.5％CMC-Na溶液(w/v)，得50mg/mL的溶液，以灌胃方式给大鼠(250±20g)独一味溶液0.8g/kg；(b)分别在给药后5min、15min、0.5h、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、12h和24h从大鼠眼眶取血0.3mL，置于1.5mL肝素化的聚乙烯管中，立即在4℃恒温离心10min，转速4000×g，得到口服独一味后的大鼠血浆。对照品溶液的制备：精密称取胡麻属苷对照品，溶于甲醇，加入内标替硝唑得储备液。以空白血浆和10％甲醇(MeOH)(v/v)稀释成不同浓度的标准溶液，得浓度分别为4.00，10.00，30.00，50.00，100.00，150.00，250ng/mL的胡麻属苷溶液。本专利技术优点在于：1、本专利技术以独一味中的胡麻属苷成分为指标，建立了大鼠口服独一味后胡麻属苷在血浆中浓度随时间变化的情况进行了研究，为独一味药物体内药动学过程研究提供了依据；2、本专利技术首次公开了大鼠服用独一味后，血浆中胡麻属苷的测定方法，使对独一味的药动学研究上了一个新台阶。3、本专利技术含量测定方法的精密度高，重现性佳，稳定性好，测定结果准确可靠，可有效评价独一味中的胡麻属苷在生物体内的药动学过程。附图说明图1是口服独一味地上部分后，大鼠血浆中胡麻属苷检测图。图2是条件优化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种口服独一味后大鼠血浆中胡麻属苷含量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)血浆的处理：将大鼠血浆加入含0.1％甲酸和200ng/mL替硝唑内标的甲醇溶液，涡旋混匀，离心，取上清液氮气流吹干，再以初始流动相复溶，作为血浆测试样品；(b)精密吸取步骤(a)得到的血浆测试样品注入高效液相色谱‑质谱联用仪，内标法定量，测得血浆中胡麻属苷的含量；其中，液相条件为：Agilent 1200HPLC液相色谱仪，反相色谱柱，柱温为35℃，流动相为：酸性乙腈和酸性水，流速为0.4mL/min，进样体积为10μL，梯度洗脱，检测时间为5min；后运行时间为5min；所述的酸性乙腈和酸性水中，加入的酸均为甲酸，浓度为0.1％；质谱条件为：Agilent 6410QQQ质谱系统，离子化方式为电喷雾条件，采用负离子条件下MRM模式，内标为替硝唑，干燥气流速为10L/min，干燥气温度为350℃，雾化气压力为40psi，毛细管电压为4000V。

【技术特征摘要】
2016.01.05 CN 20161000489021.一种口服独一味后大鼠血浆中胡麻属苷含量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)血浆的处理：将大鼠血浆加入含0.1％甲酸和200ng/mL替硝唑内标的甲醇溶液，涡旋混匀，离心，取上清液氮气流吹干，再以初始流动相复溶，作为血浆测试样品；(b)精密吸取步骤(a)得到的血浆测试样品注入高效液相色谱-质谱联用仪，内标法定量，测得血浆中胡麻属苷的含量；其中，液相条件为：Agilent1200HPLC液相色谱仪，反相色谱柱，柱温为35℃，流动相为：酸性乙腈和酸性水，流速为0.4mL/min，进样体积为10μL，梯度洗脱，检测时间为5min；后运行时间为5min；所述的酸性乙腈和酸性水中，加入的酸均为甲酸，浓度为0.1％；质谱条件为：Agilent6410QQQ质谱系统，离子化方式为...

【专利技术属性】
技术研发人员：张凤，喇明平，陈万生，龚晓斌，高守红，杨阳，孙连娜，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31