一种提高记忆的从血浆分离的混合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，提供一种提高记忆的从血浆分离的混合物及其制备方法和应用。所述混合物的SDS‑PAGE变性胶电泳具有11条肉眼清晰可见的条带，所述条带的分子量为：25kD、37kD、41kD、51kD、66kD、69kD、88kD、105kD、145kD、170kD、200kD。本发明专利技术提供的混合物可以比血浆和目前药物更有效地提升老年痴呆症患者的认知水平。与此同时，长期服用这种混合物可以大大降低长期服用西药带来的副作用和药物依赖。

Mixture for separating memory from plasma and its preparation method and Application

The invention belongs to the field of molecular biology, and provides a mixture for separating memory from plasma and a preparation method and an application thereof. The mixture of SDS PAGE denaturing gel electrophoresis with 11 clearly visible to the naked eye bands, the molecular bands were as follows: 25kD, 37kD, 41kD, 51kD, 66kD, 69kD, 88kD, 105kD, 145kD, 170kD, 200kD. The mixture provided by the invention can more effectively improve the cognitive level of the patients with Alzheimer's disease than the plasma and the present medicine. At the same time, long-term use of this mixture can greatly reduce side effects and drug dependence of long-term use of Western medicine.

【技术实现步骤摘要】
一种提高记忆的从血浆分离的混合物及其制备方法和应用
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种血浆分离物，具体地，涉及一种从血浆中分离的、用于增强记忆力的混合物及其制备方法，该混合物可用于预防、改善和治疗老年痴呆症，并具有增强记忆力的作用。
技术介绍
老年痴呆症又称为阿尔茨海默综合症，是一种渐进性大脑功能衰退的致死疾病。临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力减退，并有各神经精神症状和行为障碍。老年痴呆症致死危险性与肿瘤、心脑血管疾病等相当，严重威胁老年人的健康并对整个社会发展带来沉重的负担。此病病因复杂，发病机制尚未完全阐明，特征性病理改变为β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及神经元丢失伴随胶质细胞增生。目前老年痴呆症的药物治疗分为症状性治疗和疾病调节治疗两大类。其中仅四种药物(多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰他敏、和美金刚)的临床疗效较为肯定，已获得美国FDA批准用于临床治疗。然而，这些药物均属于症状性治疗药物，仅能改善临床症状，并不能改变疾病进程，而且这些药物主要属于化学合成药物，有不同程度的毒副作用。因此，研发能够调节老年痴呆症进程的新型药物目前尤为重要。近年的研究结果证明：给老年鼠持续注射年轻鼠的血浆能提升老年鼠的认知水平、空间记忆力、适应新环境能力(VilledaS.A.Youngbloodreversesage-relatedimpairmentsincognitivefunctionandsynapticplasticityinmice.NatureMedicine2014；20:659-663)。其可能的作用机制为血浆中含有成千上万种蛋白和多种细胞因子，年轻血浆包含可以使组织恢复活力的某些成分，随着年龄增长，这些物质会消失或被破坏。运用现代分离技术，分离浓缩对老年痴呆患者有疗效的血浆成分，用于老年痴呆病的预防和治疗，是一种新型调节老年痴呆症进程药物的发展方向。
技术实现思路
针对现有技术的缺陷，本专利技术的目的之一在于提供一种提高记忆的从血浆分离的混合物。本专利技术的目的之二在于提供上述混合物的制备方法。本专利技术的目的之三在于提供上述混合物的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种提高记忆的从血浆分离的混合物，所述混合物的SDS-PAGE变性胶电泳至少包括11条肉眼清晰可见的条带，分子量大小分别为：25kD、37kD、41kD、51kD、66kD、69kD、88kD、105kD、145kD、170kD、200kD。在本专利技术的第一方面，作为一种优选实施方式，通过蛋白质谱分析，所述混合物中至少含有如下表1所示的106种蛋白；优选地，所述混合物还包括与下文中的表1所示的蛋白中任何一种结合的小分子。在本专利技术的第一方面，作为一种优选实施方式，所述血浆来源于哺乳动物；优选地，所述血浆来源于人类。第二方面，本专利技术提供上述混合物制备方法，依次包括以下步骤：血浆收集、低温过滤、低温超滤、冷乙醇沉淀、SD灭活、离心、阴离子交换、第一次浓缩、分子筛、透析、第二次浓缩步骤；优选地，所述血浆收集和冷乙醇沉淀步骤之间还包括：低温过滤和低温超滤步骤。在本专利技术的第二方面，作为一种优选实施方式，在所述血浆收集步骤中，利用抗凝管收集血液，再通过离心收集上清液，得到血浆；优选地，所述离心中，离心力为500-1000g，时间为10-30分钟，离心温度为0-10℃。在本专利技术的第二方面，作为一种优选实施方式，在所述低温过滤步骤中，在压力条件下将所述血浆进行过滤，得到滤液；优选地，滤膜的孔径为不小于0.22微米，更优选所述滤膜的孔径为0.22微米和0.45微米；优选地，所述过滤的温度为0-5℃，压力为1-20MPa。在本专利技术的第二方面，作为一种优选实施方式，在所述低温超滤步骤中，将所述滤液通过施加压力进行膜包超滤，得到低温超滤产物；优选地，所述膜包截留分子量为3kD-10kD；优选地，所述超滤的温度为0-5℃，压力为1-20MPa；优选地，所述超滤使用的缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、HBS缓冲液中的一种；更优选地，所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.2-250mM、pH值为7.0-9.2，所述磷酸缓冲液的浓度为1.0-450mM、pH值为6.0-9.2，所述HBS缓冲液的浓度为0.5-600mM、pH值为6.4-8.4；进一步优选地，所述缓冲液为浓度180mM、pH值为8.0的Tris-盐酸缓冲液。在本专利技术的第二方面，作为一种优选实施方式，在所述冷乙醇沉淀步骤中，将所述低温超滤产物或血浆与冷乙醇混合后静置，取上清液，作为冷乙醇沉淀产物；优选地，所述冷乙醇的温度为0-10℃；优选地，所述冷乙醇和所述低温超滤产物或血浆的体积比为1：(4-8)；优选地，所述静置温度为0-6℃。在本专利技术的第二方面，作为一种优选实施方式，在所述SD灭活步骤中，将所述冷乙醇沉淀产物用浓SD灭活剂重新悬浮后静置，得到灭活产物；优选地，所述静置温度为4～37℃，时间为6～18小时；更优选为所述静置温度为20℃，时间为12小时；优选地，所述浓SD灭活剂含有0.6-4％的N-丁基三磷酸盐、1-4％的吐温。在本专利技术的第二方面，作为一种优选实施方式，在所述离心分离步骤中，将所述灭活产物离心后保留上清液，得到离心分离产物；优选地，所述离心中，离心力为2000-10000g，时间为10-20分钟，温度为0-8℃。在本专利技术的第二方面，作为一种优选实施方式，在所述阴离子交换步骤中，将所述离心分离产物加入阴离子交换柱中进行步级洗脱，收集每次得到的洗脱液，混合后得到阴离子交换产物；优选地，所述步级洗脱中，先用第一次洗脱缓冲液洗脱，得到第一次洗脱液；再用第二次洗脱液洗脱，得到废液；再用第三次洗脱液洗脱，得到第三次洗脱液；合并所述第一次洗脱液和第三次洗脱液，得到阴离子交换产物；更优选地，所述第一次洗脱液缓冲液中含有50-100mM的氯化钠，所述第二次洗脱液缓冲液含有250-300mM的氯化钠，所述第三次洗脱液缓冲液含有450-500mM的氯化钠；更优选地，所述第一次洗脱缓冲液、第二次洗脱缓冲液、第三次洗脱缓冲液均为浓度0.2-200mM、pH值7.0-9.2的Tris-盐酸缓冲液。在本专利技术的第二方面，作为一种优选实施方式，所述第一次浓缩步骤中，将所述阴离子交换产物进行浓缩，得到第一次浓缩产物；优选地，所述透析产物的体积是所述浓缩产物的大于等于5倍，更优选为5-500倍；更优选地，所述第一次浓缩产物的体积为500微升-10毫升；优选地，所述浓缩是采用浓缩管离心，所述浓缩管允许1.0-2.5KD的物质通过，所述离心中，离心力为1000-3000g，温度为2-8℃；优选地，所述浓缩是采用浓缩杯加压，所述浓缩杯允许1.0-2.5KD的物质通过，所述加压的压力为1-15MPa。在本专利技术的第二方面，作为一种优选实施方式，所述分子筛步骤中，将所述第一次浓缩产物在分子筛中洗脱，得到分子筛产物；优选地，所述洗脱的洗脱缓冲液中含有20-500mM的氯化钠；优选地，所述洗脱缓冲液为Tris-盐酸缓冲液，其浓度为0.2-200mM，其pH值为7.0-9.2；更优选地，所述洗脱缓冲液为Tris-盐酸缓冲液，其浓度为2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高记忆的从血浆分离的混合物，其特征在于：所述混合物的SDS‑PAGE变性胶电泳至少包括11条肉眼清晰可见的条带，分子量大小分别为：25kD、37kD、41kD、51kD、66kD、69kD、88kD、105kD、145kD、170kD、200kD。

【技术特征摘要】
1.一种提高记忆的从血浆分离的混合物，其特征在于：所述混合物的SDS-PAGE变性胶电泳至少包括11条肉眼清晰可见的条带，分子量大小分别为：25kD、37kD、41kD、51kD、66kD、69kD、88kD、105kD、145kD、170kD、200kD。2.根据权利要求1所述混合物，其特征在于：通过蛋白质谱分析，所述混合物中至少含有106种蛋白；优选地，所述混合物还包括与所述106种蛋白中任何一种蛋白结合的小分子；更优选地，所述106种蛋白包括：14-3-3蛋白ζ/δ、14-3-3蛋白质ε、40S核糖体蛋白S15、AP-4复合物亚基β-1、BPI折叠的家族B成员1、BPI折叠家族B成员2、DNA修复支架蛋白、Hemicentin-1的同种型2、HORMA结构域蛋白2、Igλ链、LVV-血管肽-7、L-乳酸脱氢酶B链、MOB激酶活化剂1B、NAD(P)转氢酶、RhoGDP-解离抑制剂2、SLIT-NTRK样蛋白4、S-腺苷甲硫氨酸合酶、TNFSF4蛋白、α-2-HS-糖蛋白、β-2-糖蛋白1、γ-烯醇化酶、δLf乳转铁蛋白、玻连蛋白、博来霉素水解酶、补体C1q亚组分亚基C、补体C3、翅芽启动因子同源物、触珠蛋白、催乳素诱导蛋白、蛋白argonaute-3的同种型2、蛋白S100-A9、二甲基苯胺单加氧酶2、泛素-60S核糖体蛋白L40、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白、富酪蛋白、富唾液酸性脯氨酸磷蛋白1/2、肝细胞生长因子样蛋白、谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶E、谷胱甘肽S-转移酶P、谷胱甘肽过氧化物酶3、光蛋白聚糖、果糖二磷酸醛缩酶A、过位点蛋白2、过氧化物酶体膜蛋白PMP34、过氧物毒素2、核受体共活化剂1、琥珀酰-CoA连接酶亚基α、肌动蛋白-1、基本唾液富含脯氨酸蛋白2、甲状腺素结合球蛋白、钾电压门控离子通道、碱性肽IB-6、结合高铁血红蛋白、精氨基琥珀酸合酶、聚合免疫球蛋白受体、赖氨酸-tRNA连接酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶、磷酸性簇排序蛋白2、氯离子阴离子交换剂、酶原颗粒蛋白16同源物B、霉素、膜联蛋白、脑酸可溶性蛋白1、凝血酶2、凝血因子XIIIB链、苹果酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶、前纤维蛋白同种型CRA_b、桥粒斑蛋白、桥粒芯糖蛋白-1、人源性激肽释放酶结合蛋白、溶菌酶C、乳过氧化物酶、乳腺珠蛋白-B、色素上皮衍生因子、上池蛋白、肾囊素-3、视黄醇结合蛋白4、双功能3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸合酶1、丝氨酸蛋白酶抑制剂B12、丝聚蛋白、髓过氧化物酶的同工型H14、胎球蛋白B、微管蛋白α-1A链、维生素D结合蛋白、烯醇化酶-磷酸酶E1的同种型2、细胞外基质蛋白1、纤溶酶原、锌-α-2-糖蛋白、锌指蛋白DZIP1L的同种型2、锌转运体、性激素结合球蛋白、血红蛋白、血浆激肽释放酶、血浆铜蓝蛋白、血清铁蛋白、血小板亲和蛋白、血小板亲和蛋白2的同种型1、原蛋白脂肪3、载脂蛋白A、粘蛋白-5B、脂笼蛋白1样蛋白1、中性粒细胞防御素1、转化生长因子β受体相关蛋白1、组织蛋白酶D。3.根据权利要求1所述混合物，其特征在于：所述血浆来源于哺乳动物；优选地，所述血浆来源于人类。4.一种权利要求1-3任一所述混合物的制备方法，其特征在于：该制备方法依次包括以下步骤：血浆收集、低温过滤、低温超滤、冷乙醇沉淀、SD灭活、离心、阴离子交换、第一次浓缩、分子筛、透析、第二次浓缩步骤；优选地，所述血浆收集和冷乙醇沉淀步骤之间还包括：低温过滤和低温超滤步骤。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：在所述血浆收集步骤中，利用抗凝管收集血液，再通过离心收集上清液，得到血浆；优选地，所述离心中，离心力为500-1000g，时间为10-30分钟，离心温度为0-10℃。6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：在所述低温过滤步骤中，在压力条件下将所述血浆进行过滤，得到滤液；优选地，滤膜的孔径为不小于0.22微米，更优选所述滤膜的孔径为0.22微米和0.45微米；优选地，所述过滤的温度为0-5℃，压力为1-20MPa。7.根据权利要求4-6任一所述的制备方法，其特征在于：在所述低温超滤步骤中，将所述滤液通过施加压力进行膜包超滤，得到低温超滤产物；优选地，所述膜包截留分子量为3kD-10kD；优选地，所述超滤的温度为0-5℃，压力为1-20MPa；优选地，所述超滤使用的缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、HBS缓冲液中的一种；更优选地，所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.2-250mM、pH值为7.0-9.2，所述磷酸缓冲液的浓度为1.0-450mM、pH值为6.0-9.2，所述HBS缓冲液的浓度为0.5-600mM、pH值为6.4-8.4；进一步优选地，所述缓冲液为浓度180mM、pH值为8.0的Tris-盐酸缓冲液。8.根据权利要求4-7任一所述的制备方法，其特征在于：在所述冷乙醇沉淀步骤中，将所述低温超滤产物或血浆与冷乙醇混合后静置，取上清液，作为冷乙醇沉淀产物；优选地，所述冷乙醇的温度为0-10℃；优选地，所述冷乙醇和所述低温超滤产物或血浆的体积比为1：(4-8)；优选地，所述静置温度为0-6℃。9.根据权利要求4-8任一所述的制备方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔文宏，张丽丽，孔毅荣，郝敬雨，石浩威，任园园，
申请(专利权)人：田野，
类型：发明
国别省市：北京,11