一种适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系的制备方法及通过该制备方法获得的MDCK细胞系技术

本发明专利技术公开了一种适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系的制备方法及通过该制备方法获得的MDCK细胞系，包括以下步骤：1)弃去培养MDCK细胞的培养基，用胰酶溶液清洗细胞层后弃去溶液；再次加入胰酶溶液对MDCK细胞进行消化；待细胞变圆后终止消化；然后将细胞悬液离心后弃上清，获得细胞团；2)将步骤1)中获得的细胞团用无血清培养基进行重悬，获得细胞重悬液；3)将步骤2)中获得的细胞重悬液置于摇床中并放入培养箱中培养，用无血清培养基将细胞重悬液稀释，进行传代，得到MDCK细胞系；该MDCK细胞系的细胞密度高，呈单个分散生长，形态饱满，大小均一，活性大，适用于生物反应器无血清悬浮培养。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞系培养驯化领域，具体涉及一种适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系的制备方法及通过该制备方法获得的MDCK细胞系。
技术介绍
犬肾脏上皮细胞(Madin-Darby canine kidney cell,MDCK)被视为最适用于甲、乙型流感病毒疫苗生产的细胞系之一，可被用于代替鸡胚培养流感病毒。目前已经开发了利用MDCK细胞系代替鸡胚培养流感病毒的微载体贴壁培养生产工艺方法，虽然此工艺方法以可达到的一定的生产规模，然而还是存在一定的缺陷：1、微载体难以多次重复使用，造成生产成本提高；2、贴壁细胞的培养密度受到贴壁面积的限制，致使病毒产量的下降；3、贴壁培养通常需添加血清以帮助细胞贴附和生长，需要进行换液，工艺复杂，并且会引入支原体、衣原体或动物蛋白的污染，对疫苗产品的安全性造成潜在威胁。而采用无血清全悬浮培养MDCK细胞的技术，可以克服贴壁培养的缺点，但是需要对MDCK细胞进行驯化。间接法驯化无血清悬浮培养MDCK细胞分为两个阶段进行，首先，用无血清培养基驯化贴壁MDCK细胞，使其可在无血清条件下贴壁生长；然后用无血清培养基继续驯化，使其在不需要载体的悬浮状态下生长本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)将需血清贴壁培养的MDCK细胞用培养基培养至细胞汇合度达到80～90％时，弃去培养MDCK细胞的培养基，用胰酶溶液清洗细胞层后弃去溶液；再次加入胰酶溶液至覆盖MDCK细胞进行消化5～15min；待细胞变圆后加入含胎牛血清的培养基终止消化；然后收集细胞悬液，并将细胞悬液离心后弃上清，获得细胞团；2)将步骤1)中获得的细胞团用无血清培养基进行重悬至细胞密度1.3～1.6×106cells/mL，获得细胞重悬液；3)将步骤2)中获得的细胞重悬液加入方瓶，在转速30rpm、温度37℃、5％CO2的条件下置于摇床中并放入培养...

【技术特征摘要】
1.一种适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)将需血清贴壁培养的MDCK细胞用培养基培养至细胞汇合度达到80～90％时，弃去培养MDCK细胞的培养基，用胰酶溶液清洗细胞层后弃去溶液；再次加入胰酶溶液至覆盖MDCK细胞进行消化5～15min；待细胞变圆后加入含胎牛血清的培养基终止消化；然后收集细胞悬液，并将细胞悬液离心后弃上清，获得细胞团；2)将步骤1)中获得的细胞团用无血清培养基进行重悬至细胞密度1.3～1.6×106cells/mL，获得细胞重悬液；3)将步骤2)中获得的细胞重悬液加入方瓶，在转速30rpm、温度37℃、5％CO2的条件下置于摇床中并放入培养箱中培养，经过2代培养后将培养的细胞重悬液转入摇瓶，转速提升至120rpm；每隔48h用新鲜的无血清培养基将细胞重悬液稀释至细胞密度为1.3～1.6×106cells/mL，进行传代，获得适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系。2.如权利要求1所述的适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述用于培养MDCK细胞的培养基为含10％新生牛血清的DMEM培养基。3.如权利要求1所述的适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述含胎牛血清的培养基为含10％...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖汉漳，陈瑞爱，刘玉鹏，詹烜子，刘旭平，麦康聪，汤钦，盘伟岚，许东蕾，陈华坚，
申请(专利权)人：广东温氏大华农生物科技有限公司，华东理工大学，肇庆大华农生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44