甲型肝炎减毒活疫苗及其制造方法技术

本发明专利技术是一种含有甲型肝炎病毒经减毒后保持抗原性的医用生物药品，用于预防人类由该病毒引起的甲型肝炎。其减毒活疫苗是使用减毒后的病毒在人胚肺二倍体细胞上培养繁殖，经氯仿抽提和经各种生物学检测而获得的。经大量人群接种观察，证明该疫苗安全有效，接种者９５％以上可获得免疫力，为预防甲型肝炎提供了安全有效的活疫苗。（*该技术在2012年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是一种含有甲型肝炎病毒性抗原的医用生物药品，用于预防人类甲型肝炎的减毒活疫苗及其制造方法。甲型肝炎是一种传染性疾病，其传染的范围之广，传染的速度之快是相当惊人的。尤其是在中国每年有数十万人患此种疾病。由于该病的高发病率和病程较长，因此给人们的身体健康以及经济发展带来严重影响。中国专利公报公开了一种“甲型肝炎减毒活疫苗毒种(H2减毒株)及其制造方法，其申请号是89106580.6，该专利申请为甲型肝炎减毒活疫苗提供了毒种，从而为防止甲型肝炎流行提供了可靠保障，但是依我国实情，要控制甲肝流行其最有效最根本的措施在于大力发展甲肝减毒活疫苗。本专利技术的目的在于提供一种安全有效的，以便有效地直接用于预防甲型肝炎的传染。本专利技术的技术方案是采用人胚肺二倍体细胞作为甲肝病毒繁殖基质，接种疫苗毒种后在32-36℃温度下培养3-4周，之后收获感染的细胞，并经冻融、超声波处理、氯仿抽提，收取疫苗病毒液，通过感染性滴度测定，纯毒试验和猴体残余毒力试验及免疫原性检定等检测合格即为甲肝减毒活疫苗成品，该疫苗内含纯一的甲型肝炎疫苗病毒颗粒，且病毒颗粒系直径为27nm的球形体，以实心颗粒为主，其氯化铯浮力密度在1.33-1.4cm3/ml，耐热性较强，60℃30分钟对其感染性无明显影响，100℃5分钟可使之灭活，在KMB17细肥中增殖20-28天达高峰滴度，TCID50为107.0-108.5/ml。本专利技术的具体工艺方法为1、以人胚肺二倍体细胞KMB17株作为甲肝病毒繁殖基质，传15-40代成为生产用细胞，将该细胞在37℃培养形成单层后，弃上清、用P·B·S缓冲液洗涤;2、接种甲肝病毒减毒毒种(1∶50-1∶100)于洗涤后的细胞瓶中，置35-37℃吸附1-2小时，补充适量的MEM维持液，置32-36℃培养26-30天，培养可采用静止或旋转方式，旋转培养时的转速为8-12转/小时，在培养期间可更换维持液1-3次。3、将培养到期的细胞弃上清，细胞单层用P.B.S缓冲液反复冲洗后，用胰酶EDTA消化分散，加入P.B.S缓冲液悬浮感染细胞并收集，经离心沉淀，弃上清，在沉淀物中加入适量生理盐水制备成感染细胞悬液，置-20℃以下保存，或进行下一步处理;4、将感染细胞悬液用超声和冻融处理2-3次，每次3-10分钟，冻融温度为-60℃。5、在病毒液中按1∶1(V/V)加入氯仿充分摇动，3000-10000rpm离心30-60分钟，收取上层水相，在余下氯仿相及沉淀物中加入生理盐水再重复此操作2-3次，合并各次氯仿抽提上清液，于3-5℃，10000-12000rpm离心10-30分钟，收集上清液，即成为疫苗半成品。8、对疫苗半成品进行各种生物学检测后，灌装安瓿，进行物理性检查和安全性检查，合格后即为疫苗产品。本专利技术具有下列优点和积极效果采用本专利技术提供的技术方案生产出来的甲肝减毒活疫苗，经我国湖南、广东、四川和云南等五省市进行的扩大人体使用观察，并根据所收集到的大量资料表明，甲型肝炎减毒活疫苗的血清抗体阳转率达95%以上，具有免疫原性好、无不良副反应等特点(见表1、表2)，是预防甲型肝炎的特效制剂，也是公认的控制和预防甲肝流行最有效的手段。实施例自液氮容器内取出KMB17细胞安瓿，系统标化的生产用细胞种子第13-19世代安瓿，去原保存液，加入含有10%新生牛血清的Eagle及0.15-0.30%乳蛋白营养液，置36.5-37.5℃复 培养待形成细胞单层后，进行连续传代培养。采用PBS洗涤、胰酶-EDTA消化、含5-10%新生牛血清的Eagle及0.15-0.30%乳蛋白营养液、置36.5-37.5℃，以1∶2-1∶8分种率每3-7天传代一次，直至获得批量生产需用的足量细胞。取甲型肝炎减毒活疫苗毒种(H2减毒株)，系批量制备并经标化的生产用毒种H2M20K6-H2M20K10，以1∶50-1∶100分种率接种克氏瓶、罗氏瓶或转瓶培养的KMB17细胞第25-40世代，35-37℃吸附1-2小时，用含2%新生牛血清的Eagle及0.15-0.30%乳蛋白维持液，置32-36℃静止或旋转(转速8-12转/小时)培养26-30天，其间更换维持液1-3次。培养终了，去原维持液，用PBS洗涤，胰酶-EDTA消化并收集细胞，收集的感染细胞经反复冻融2-3次，间以超声波处理(375-1500W超声波仪，每次3-10分钟)，使细胞粉碎，用等量分析纯氯仿抽提2-3次，10，000rpm离心30-60分钟去除沉淀，上清液合并成为疫苗半成品。以无热原注射用平衡盐溶液稀释疫苗半成品，分装小瓶或安瓶制成疫苗成品。疫苗成品系无菌、无杂质异物、对人体无害的液体，内含纯一甲型肝炎减毒活疫苗颗粒，残余牛血清含量不超过1ng/人份剂量。疫苗半成品经下列项目检验。1、无菌试验2、感染性滴度测定3、抗原性滴度测定4、氯仿残余含量测定5、牛血清残余含量测定6、型特异性检定7、猴体残余毒力及免疫原性试验以上各项检查合格，疫苗分装入安瓿，再经物理性状检查和安全检查，合格后即为产品。表1 甲肝减毒活疫功接种对象年龄和地区分布 表2 五个观察点的血清学反应地区 试验人数 阳转人数 阳转率(%) 几何平均滴度内江 121 118 97.52 5.19湘谭 101 94 93.07 3.21株州 104 104 100.00 5.30济阳 95 92 96.84 4.40昆明 137 133 97.08 3.60合计 558 541 96.9 4.3权利要求1.一种以人胚肺二倍体细胞为细胞基质接种甲型肝炎减毒活疫苗毒种经培养繁殖、氯仿抽提、各种生物学检测而获得，其特征在于a、采用第15-40代人胚肺二倍体细胞作为生产用细胞，按1∶50～1∶100的比例分种率接种甲肝减毒毒种，在35-37℃吸附1-2小时补充MEM维持液，置32-36℃静止或旋转培养，培养时间为26-30天；b、去掉培养到期的细胞原维持液，用PBS洗涤，用胰酶-EDTA消化分散并收集细胞，经离心沉淀，弃上清，在沉淀物中加入生理盐水制备成感染细胞悬液，置-20℃以下保存或直接进行下步处理；c、将感染细胞悬液用超声和冻融处理2-3次，每次3-10分钟，冻融温度为-60℃，使细胞破碎，充分释放出细胞内的病毒颗粒；d、病毒液用氯仿抽提2-3次，3000-10000rpm离心30-60分钟去除沉淀，合并各次上清液，于3-5℃10，000-12000rpm离心10-30分钟即得疫苗半成品；再经各项生物特性试验后，分装小瓶或安瓿制成疫苗成品。2.根据权利要求1所述的，其特征在于a步骤中旋转培养的转速为8-12转/小时，在培养期间可更换维持液1-3次。3.根据权利要求1所述的，其特征在于疫苗半成品经过无菌试验，感染性滴度测定，抗原性滴度测定，氯仿残余量测定，牛血清残余含量测定，型特异性检定，猴体残余毒力及免疫原性试验等合格后装瓶，再做物理性状检查和安全性检查，合格即为产品。4.根据权利要求1所述的甲型肝炎减毒活疫苗，其特征在于该活疫苗内含纯一的甲型肝炎疫苗病毒颗粒，且颗粒系直径为27nm的实心球体，氯化铯浮力密度1.33-1.4cm3/ml，耐热性强，60℃30分钟对其感染性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以人胚肺二倍体细胞为细胞基质接种甲型肝炎减毒活疫苗毒种经培养繁殖、氯仿抽提、各种生物学检测而获得甲型肝炎减毒活疫苗及其制造方法，其特征在于：ａ、采用第１５－４０代人胚肺二倍体细胞作为生产用细胞，按１∶５０～１∶１００的比例分种率接种甲肝减毒毒种，在３５－３７℃吸附１－２小时补充ＭＥＭ维持液，置３２－３６℃静止或旋转培养，培养时间为２６－３０天；ｂ、去掉培养到期的细胞原维持液，用ＰＢＳ洗涤，用胰酶－ＥＤＴＡ消化分散并收集细胞，经离心沉淀，弃上清，在沉淀物中加入生理盐水制备成感染细胞悬液，置－２０℃以下保存或直接进行下步处理；ｃ、将感染细胞悬液用超声和冻融处理２－３次，每次３－１０分钟，冻融温度为－６０℃，使细胞破碎，充分释放出细胞内的病毒颗粒；ｄ、病毒液用氯仿抽提２－３次，３０００－１００００ｒｐｍ离心３０－６０分钟去除沉淀，合并各次上清液，于３－５℃１０，０００－１２０００ｒｐｍ离心１０－３０分钟即得疫苗半成品；再经各项生物特性试验后，分装小瓶或安瓿制成疫苗成品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：董德祥，毛江森，曹逸云，陈统球，张华远，周德久，陈淑范，刘开民，万宗举，陈念良，任丽萍，胡云章，李河民，朱既明，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]