本发明专利技术公开了一种检测Ａ群轮状病毒的试剂盒和寡核苷酸序列，具体涉及一组检测Ａ群轮状病毒的寡核苷酸，具有序列表ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１至ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５所示的寡核苷酸序列，含有这些寡核苷酸的试剂盒及其检测方法，本发明专利技术所述的试剂盒灵敏度高、特异性强、成本低、操作简便。检测时，在核酸大量合成时，产生副产物—焦磷酸镁沉淀，有极高的特异性，只要用肉眼观察扩增产物浊度就能够判断扩增与否。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测A群轮状病毒的试剂盒和寡核苷酸，更具体地说，是一种检测A群轮状病毒的反转录一环介导等温扩增(RT-LAMP)快速检测试剂盒，具体而言是指利用RT-LAMP原理快速检测A群轮状病毒的寡核苷酸序列、试剂盒和方法，属生物
技术介绍
轮状病毒(Rotavirus)属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属。呈球形，直径60~80 nm，双层衣壳，无包膜，负染后在电镜下观察，病毒外形呈车轮状，故名轮状病毒。是双链RNA病毒，约18550 bp，由ll个基因片段组成，每个片段含一个开放读码框架，分别编码6个结构蛋白(VP1、 VP2、 VP3、 VP4、 VP6、 VP7)和5个非结构蛋白(NSP1-NSP5)。根据轮状病毒内衣壳VP6的抗原性，可将其分为7个组(A G)。 A群轮状病毒最为常见，于世界范围内流行，是婴幼儿腹泻的主要原因。据统计，A群轮状病毒每年可导致600,000 800,000儿童死亡，在发展中国家约占因急性胃肠炎住院病例的30 60%。此外，轮状病毒作为一种重要的食源性病毒，可通过粪一口途径传播，污染的水和食物尤其贝类是传播的主要载体。贝类作为滤过性摄食动物，很容易富集病毒。目前贝类养殖和收获后所使用的净化方法，只对细菌性污染起作用，对病毒无效。另外，为保持口感鲜嫩，人们喜欢食用生的或半熟的贝类。因此进食生的或者未经适当烹制的贝类，极易引起病毒性腹泻病的流行和暴发，同时也会给水产业带来巨大的经济损失。因此，研究开发针对轮状病毒的快速检测方法，可广泛应用于临床诊断、卫生防御、食品安全检测以及水产养殖等领域，对保护人民健康，促进我国水产和食品贸易的发展都具有重要的意义。以往轮状病毒的检验主要采用电镜观察、分离培养和酶联免疫方法(ELISA)。然而，由于电镜设备昂贵，检测灵敏度低，在很大程度上限制了其应用；分离培养方法灵敏度较低，需要特殊培养条件，而且周期长，不适于轮状病毒的快速检测；ELISA方法操作简便，价格低廉，灵敏度和特异性教高，但是其检测依赖于特异性抗原一抗3体反应，容易受到环境条件和样品中干扰物质的影响。近年来以核酸扩增为基础的分子生物学技术已成为轮状病毒检测的主要手段，但仍存在不同的缺陷。如RT-PCR，通常需要4 5个小时，检测结果需要通过核酸电泳、紫外观察，不但容易造成对环境的交叉污染，对操作人员也具有一定的毒性作用。实时荧光RT-PCR因其灵敏度高、特异性强、可用于定量检测而倍受欢迎，但同时也对仪器设备和操作人员的技术条件提出了更高的要求，而且试验中所用试剂和探针等费用较为昂贵，这些都为轮状病毒检测的广泛开展带来了一定的困难。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术是2000年由Notomi等人开发的一种新颖的核酸扩增方法。其特点是针对靶基因的6 8个区域设计4 6种特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNApolymerase),在等温条件(65 'C左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。该方法不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，亦不需要精密的仪器与昂贵的检测试剂。因其操作简单、结果直观、灵敏度高、特异性强，已被广泛地应用于病原微生物的检测和传染性疾病的诊断。近年来我国已开始着手于致病性细菌的LAMP检测技术研究，如结核分支杆菌、痢疾志贺氏菌、大肠艾希氏菌、肺炎链球菌、耶氏菌以及食品中常见的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌以及副溶血性弧菌等，取得了显著的成效；而针对病毒的LAMP检测主要见于国外的部分报道，如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒、腺病毒等DNA病毒以及流感病毒、SARS冠状病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、西尼罗河病毒等RNA病毒。目前国内外均未见利用RT-LAMP技术对轮状病毒进行检测的相关报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测A群轮状病毒的RT-LAMP寡核苷酸。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种操作简单、结果准确的A群轮状病毒RT-LAMP快速检测试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案本专利技术提供一组检测A群轮状病毒的寡核苷酸，由序列表SEQIDNo.l至序列表SEQIDNo.5所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQ IDNo.l为外侧上游引物，SEQIDNo.2为外侧下游引物，SEQIDNo.3为内侧上游引物，SEQ ID No.4为内侧下游引4物，SEQIDNo.5为环引物。详见表l。表1 A群轮状病毒RT-LAMP引物序列引物名称引物序列(5'-3') 序列编号外侧上游 TCTTCAAAATGTCATCTCACAA SEQ ID引物(F3) No.l外侧下游 CGTCTATAGCATTAATGGGATT SEQ ID引物(B3) No.2引物(FIP) No.3引物(BIP) No.4环引物GGTCTATGGAACTACCAGATGATGT SEQ ID(LB) No.5本专利技术所提供的引物具有以下优点(1)高效灵敏。近年来的研究显示引入环引物(LoopF或LoopB)将有助于提高灵敏度，縮短反应时间。本专利技术设计出轮状病毒特异的环引物(LoopB)，有效提高了检测灵敏度，在60min的时间内，扩增效率可达到109 101()个数量级，扩增模板极限可达单拷贝轮状病毒核酸。(2)特异性强，采用5条引物，共识别轮状病毒NSP3基因的7个不同位点，充分保证扩增反应的特异性。本专利技术还提供一种检测A群轮状病毒的试剂盒，由以下试剂组成-(1) TRIZOL裂解液购自Invitrogen公司，货号15596-026;(2) DEPCZK:购自上海生工，货号D1005;(3) 2xRT-LAMP反应液其组分为2xThermoPo1缓冲液、1.6 M甜菜碱、3.6 mMdNTPs、 8mMMgS04、 0.4 [iM外侧上游引物(F3)、 0.4pM外侧下游引物(B3)、 3.2 (iM内侧上游引物(FIP)、 3.2pM内侧下游引物(BIP)、 1.6^M环引物(LB);其中外侧上游引物(F3)是序列表SEQIDNo.l所示的核苷酸序列，外侧下游引物(B3)是序列表SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，内侧上游引物(FIP)是序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，内侧下游引物(BIP)是序列表SEQIDNo.4所示的核苷酸序列，环引物(LB)是序列表SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；引物委托大连宝生物工程有限公司合成；(4) BstDNA聚合酶8U小L，购自NEB公司，货号M0275L;(5) AMV反转录酶，10U/pL，购自Promega公司，货号M510A;(6) 阴性对照生理盐水；(7) 阳性对照体外转录的A群轮状病毒RNA片段或含A群轮状病毒靶基因的质粒DNA;(8) 显色液SYBRGreenI染料，购自Invitrogen公司，货号S7563;其中所述2xRT-LAMP反应液中2xThermoPo1缓冲液是由lOxThermoPol缓冲液(购自NEB公司，货号M0275L)稀释而成。2xThermoPo1缓冲液含有0.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组检测Ａ群轮状病毒的寡核苷酸，其特征在于：由序列表ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１至序列表ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１为外侧上游引物，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２为外侧下游引物，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３为内侧上游引物，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４为内侧下游引物，ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５为环引物。
【技术特征摘要】
1.一组检测A群轮状病毒的寡核苷酸，其特征在于由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.5所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQ ID No.1为外侧上游引物，SEQ ID No.2为外侧下游引物，SEQ ID No.3为内侧上游引物，SEQ ID No.4为内侧下游引物，SEQ ID No.5为环引物。2. —种检测A群轮状病毒的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成(1) TRIZOL裂解液；(2) DEPC7K;(3) 2xRT-LAMP反应液其组分为2xThermoPo1缓冲液、1.6 M甜菜碱、3.6 mMdNTPs、 8mMMgS04、 0.4 pM外侧上游引物、0.4pM外侧下游引物、3.2 pM内侧上游引物、3.2pM内侧下游引物、1.6pM环引物；外侧上游...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏海燕，曾静，王金花，周琦，张西萌，
申请(专利权)人：中华人民共和国北京出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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