一种基于荧光素和萤光素酶生物发光反应的免疫分析方法技术

本发明专利技术提供一种基于荧光素和萤光素酶生物发光反应的免疫分析方法及其应用。该方法包括步骤：(1)将包被物质包被在固相载体上，孵育后用缓冲液冲洗；(2)加入待测物标准品溶液，孵育后用缓冲液冲洗；(3)加入ALP标记的二抗，孵育后用缓冲液冲洗，所述二抗为抗待测物的抗体；(4)加入ATP溶液反应后，再加入生物发光底物反应，最后检测发光值，获得结果I；(5)将步骤(2)中所述的待测物标准品溶液替换成待测样品溶液，重复进行步骤(1)～(4)的操作，最后检测发光值，获得结果II，将结果II参比结果I，换算得到样品溶液中待测物的浓度；本发明专利技术的免疫分析方法灵敏度高、信号读出方式简单、检测线性范围宽、分析速度快。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫检测分析
，具体涉及一种基于荧光素和萤光素酶生物发光反应的免疫分析方法及其应用。
技术介绍
构建高灵敏分析方法一直是分析化学领域追求的目标之一，高灵敏分析方法推动了分析化学的发展及其在临床诊断、环境监测、食品安全、生物成像等领域的应用。在重大传染病、细菌或病毒感染、癌症等疾病的早期诊断以及食品和环境中痕量有毒物质的筛查中，高灵敏分析方法显得尤为重要。以抗体-抗原特异性识别为基础的免疫生物标记分析方法是一种将生物标记技术的高灵敏性和免疫反应的高度特异性结合在一起的分析方法，具有灵敏度高、特异性好、分析快速等优点。酶联免疫是其中的代表，该方法具有特异性强、重复性好、操作简单、成本低、易于商品化和自动化等优点。但传统的酶联免疫分析方法一般都是基于免疫标记酶和底物之间的一次酶促信号放大，其灵敏度只能达到ng/mL。在需要高灵敏度的分析领域，传统的酶联免疫分析方法很难满足需要，因此，如何实现简单便捷的高灵敏免疫分析仍是分析化学领域的重要挑战之一。目前，高灵敏的免疫分析方法的实现主要依赖：1)样品中目标物的有效富集和扩增；2)有效的信号放大策略。基于纳米磁珠的免疫磁富集方法能有效富集样品中目标物，具有操作简单、分离速度快、富集效率高等优势，在免疫分析中得到了广泛的应用。同时，采用合适的信号放大策略对于免疫分析方法灵敏度的提高至关重要。近些年来，研究者们已经发展出一系列的信号放大方法，主要包括：(1)基于纳米材料的信号放大系统：新型纳米材料(纳米磁珠，胶体金，量子点，石墨烯，硅基纳米材料等)具有比表面积大，稳定性和生物兼容性好等优点，可以偶联大量的信号报告基团如荧光分子或酶，达到信号放大的目的。(2)基于click反应的信号放大系统：click反应是指一类具有立体选择性，反应条件简单，反应快速的化学反应，已经在生物偶联、临床诊断、细胞成像、生物传感等领域得到了广泛应用。免疫分析方法中，抗体可以通过click可控反应偶联上更多的酶或者其他信号报告分子，从而提高了方法的灵敏度。(3)基于核酸扩增的信号放大系统：将核酸扩增技术如聚合酶链式反应和环介导等温扩增与免疫分析方法相结合，将待分析物的信号转换为核酸信号进行分析，从而改善现有方法的灵敏度，但该方法操作比较复杂，影响了其实际应用。上述3类放大系统尽管可以改善分析方法的灵敏度(提高1-2个数量级)，但其放大效果还是会受到多方面的限制。例如，在免疫分析中，基于click反应的多步信号放大系统会增加实验步骤，影响了分析的速度和准确性。基于核酸扩增的信号放大系统实验操作比较复杂，影响了其实际应用。因此，有必要研究开发灵敏度更高、分析速度更快、信号输出读取方式更为简单的免疫分析方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前的免疫分析方法在检测灵敏度、分析速度和信号读出方式等方面不能满足实际应用需求的情况，而提供一种基于荧光素和萤光素酶生物发光反应的免疫分析方法及其应用。本发明的免疫分析方法基于“ATP-荧光素-荧光素酶”生物发光反应而进行，具有灵敏度高、信号读出方式简单、检测线性范围宽、分析速度快等优势。为实现上述目的，本专利技术提供下述技术方案。本专利技术提供的技术方案之一是：一种基于生物发光反应的免疫分析方法，其包括如下步骤：(1)将包被物质包被在固相载体上，孵育后用缓冲液进行冲洗；(2)加入具有不同浓度梯度的待测物标准品溶液，孵育后用缓冲液进行冲洗；(3)加入以ALP标记的二抗，孵育后用缓冲液进行冲洗，所述二抗为抗待测物的抗体；(4)加入ATP溶液反应后，再加入生物发光底物进行反应，最后检测发光值，获得结果I；(5)将步骤(2)中所述的不同浓度梯度的待测物标准品溶液替换成待测样品溶液，重复进行步骤(1)～(4)的操作，最后检测发光值，获得结果II，将结果II参比结果I，判断待测样品溶液中待测物的浓度；其中，当待测物为完全抗原时，所述包被物质为能够与所述完全抗原对应结合且与所述二抗具有不同抗原结合位点的抗体，当待测物为抗体时，所述包被物质为与所述抗体对应的完全抗原或半抗原分子与蛋白质载体偶联形成的人工抗原；所述的生物发光底物为含有荧光素和荧光素酶的溶液。本专利技术中，步骤(1)为：将包被物质包被在固相载体上，孵育后用缓冲液进行冲洗。如本领域常规，所述的包被物质为捕获物质，一般是抗体，如果是半抗原分子，则将半抗原分子与蛋白质载体偶联后再进行包被。所述的包被物质能够特异性结合步骤(2)中所述的待测物。所述的固相载体为免疫检测领域常规所述的各类固相载体，其对于具体材质和规格并没有特殊的要求，只要其适于包被以及进行其他常规免疫反应操作即可。优选地，所述的固相载体为酶标板，本领域各种常规材质和规格的酶标板均适用于本专利技术。所述孵育为本领域的常规操作，一般是将包被后的固相载体置于合适的温度条件下放置数小时，待包被物质牢固吸附于固相载体即可。优选地，所述孵育为将包被后的固相载体置于4～40℃放置0.5～12小时，更优选于37℃放置2小时。所述缓冲液为本领域常规，各类用于冲洗过量包被物质的缓冲液均适用于本专利技术，可以视不同的检测反应体系而进行具体选择。优选地，所述缓冲液为PBS缓冲液，更优选含有1‰吐温-20的PBS缓冲液，所述千分比指体积千分比。所述冲洗为本领域的常规操作，一般是往固相载体上加入缓冲液，静置数分钟后甩净拍干，一般冲洗数次。本专利技术中，步骤(2)为：加入具有不同浓度梯度的待测物标准品溶液，孵育后用缓冲液进行冲洗；其中，所述待测物为待检测的物质，其与步骤(1)中所述的包被物质能够发生特异性的结合，其属性一般为完全抗原或者是抗体。所述抗体的来源没有特别限制，如可以是将步骤(1)中所述的包被物质免疫各类哺乳动物而获得的抗体，如鼠抗或兔抗，其类型也没有特殊要求，既可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。所述孵育同步骤(1)，其是本领域的常规操作，一般是将固相载体置于合适的温度条件下放置数小时，待添加物牢固吸附于固相载体上即可。优选地，所述孵育为将固相载体置于4～40℃放置0.5～12小时，更优选于37℃放置2小时。所述缓冲液同步骤(1)，其为本领域常规，各类用于冲洗过量添加物的缓冲液均适用于本专利技术，可以视不同的检测反应体系而进行具体选择。优选地，所述缓冲液为PBS缓冲液，更优选含有1‰本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于生物发光反应的免疫分析方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)将包被物质包被在固相载体上，孵育后用缓冲液进行冲洗；(2)加入具有不同浓度梯度的待测物标准品溶液，孵育后用缓冲液进行冲洗；(3)加入以ALP标记的二抗，孵育后用缓冲液进行冲洗，所述二抗为抗待测物的抗体；(4)加入ATP溶液反应后，再加入生物发光底物进行反应，最后检测发光值，获得结果I；(5)将步骤(2)中所述的不同浓度梯度的待测物标准品溶液替换成待测样品溶液，重复进行步骤(1)～(4)的操作，最后检测发光值，获得结果II，将结果II参比结果I，判断待测样品溶液中待测物的浓度；其中，当待测物为完全抗原时，所述包被物质为能够与所述完全抗原对应结合且与所述二抗具有不同抗原结合位点的抗体，当待测物为抗体时，所述包被物质为与所述抗体对应的完全抗原或半抗原分子与蛋白质载体偶联形成的人工抗原；所述的生物发光底物为含有荧光素和荧光素酶的溶液。

【技术特征摘要】
1.一种基于生物发光反应的免疫分析方法，其特征在于，其包
括如下步骤：
(1)将包被物质包被在固相载体上，孵育后用缓冲液进行冲洗；
(2)加入具有不同浓度梯度的待测物标准品溶液，孵育后用缓
冲液进行冲洗；
(3)加入以ALP标记的二抗，孵育后用缓冲液进行冲洗，所
述二抗为抗待测物的抗体；
(4)加入ATP溶液反应后，再加入生物发光底物进行反应，
最后检测发光值，获得结果I；
(5)将步骤(2)中所述的不同浓度梯度的待测物标准品溶液
替换成待测样品溶液，重复进行步骤(1)～(4)的操作，最后检测
发光值，获得结果II，将结果II参比结果I，判断待测样品溶液中待
测物的浓度；
其中，当待测物为完全抗原时，所述包被物质为能够与所述完
全抗原对应结合且与所述二抗具有不同抗原结合位点的抗体，当待
测物为抗体时，所述包被物质为与所述抗体对应的完全抗原或半抗
原分子与蛋白质载体偶联形成的人工抗原；
所述的生物发光底物为含有荧光素和荧光素酶的溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所
述的固相载体为酶标板。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，
所述孵育为将包被后的固相载体置于4～40℃放置0.5～12小时，更优
选于37℃放置2小时；和/或，
所述缓冲液为PBS缓冲液，更优选含有1‰吐温-20的PBS缓
冲液，所述千分比指体积千分比。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，
所述孵育为将固相载体置于4～40℃放置0.5～12小时，更优选于
37℃放置2小时；和/或，
所述缓冲液为PBS缓冲液，更优选含有1‰吐温-20的PBS...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋兴宇，陈翊平，
申请(专利权)人：国家纳米科学中心，
类型：发明
国别省市：北京;11