一种凋落物中总多酚含量的测定方法技术

本发明专利技术涉及一种多酚含量的测定方法，尤其涉及一种凋落物中总多酚含量的测定方法。采用乙醇溶液进行前处理，离心后以Folin–Ciocalteu试剂作为氧化剂将被测物质定量氧化，最后采用多功能酶标仪进行定量分析。本发明专利技术优化了总多酚，特别是凋落物中总多酚含量的测定条件，提高了准确性、缩短了测定时间、节约了成本，适合大规模样本的定量检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种多酚含量的测定方法，尤其涉及一种凋落物中总多酚含量的测定方法。
技术介绍
植物单宁又称植物多酚，是一类广泛存在于植物体内的多元酚化合物，在维管植物中的含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素，主要存在于植物的皮、根、叶、果中，含量可达20％。凋落物中的多酚是一种难以分解的聚合物，其含量通常会显著影响凋落物的分解速度，多酚含量越高，凋落物分解越慢。凋落物中的多酚在植物与环境的协同演化中扮演了重要角色，富含多酚的叶和根等凋落物进入土壤，会影响土壤中的微生物活性、矿质元素的有效性和有机氮的分解，能够使植物自身成为环境中的优势种群。此外，凋落物多酚能够减少养分流失，使植物周围环境中的养分保持在较高水平。测定凋落物中总多酚含量对于理解多酚通过凋落物分解和淋溶进入土壤中参与养分循环具有重要意义，同时能为多酚类物质参与森林生态系统的调节功能提供重要依据。目前，常见的总多酚含量的测定方法有高锰酸钾法、普鲁士蓝法、酒石酸亚铁法、福林酚法、气相色谱和高效液相色谱等。其中高锰酸钾法简便易行，但滴定终点较难发现，测定灵敏度较低，被测液中的还原性物质一般均能被氧化，选择性不高。普鲁士蓝法不够稳定，对反应时间非常敏感，反应时间如果控制不恰当，结果误差较大。离子沉降法如酒石酸亚铁法利用多酚取代基能与一些金属离子络合成有色螯合物的性质，用离子沉降的方法定量多酚，这种方法克服了植物样品中蛋白质和还原性物质的干扰，但线性范围难以控制，不同样品中的多酚线性范围有很大不同。纸层析、薄层层析法在分离效果、分离速度和准确定量方面存在缺陷。气液色谱用于植物酚类物质的分离测定具有速度快、灵敏度高的优点，但需衍生化处理，前处理步骤繁琐，且成本昂贵，不适于大规模样本的定量分析。而福林酚法(Folin–Ciocalteu法)利用Folin–Ciocalte试剂中钨钼酸在碱性条件下可以将多酚化合物定量氧化，自身被还原(W6+变为W5+)生成蓝色的化合物，蓝色化合物最大吸收波长在600-900nm之间，其反应液颜色的深浅程度与含酚基团的数目成正比。由于Folin–Ciocalteu法可以定量氧化多酚化合物，其精确度和可靠性得到了保证，另外，由于实验方法简单，减少了前处理的麻烦，节约了实验成本，检测生成物时采用多功能酶标仪，提高了准确性和精密度，缩短了测定时间，适合大规模样本的定量检测。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是如何快速准确测定凋落物中总多酚的含量，以及对含量测定时的试剂浓度及用量、前处理条件、反应体系、检测装置、检测波长等因素进行优化。为解决上述问题，本专利技术提供一种凋落物中总多酚含量的测定方法，采用一定体积和浓度的乙醇溶液进行前处理，离心后以Folin–Ciocalteu试剂作为氧化剂将被测物质定量氧化，最后采用多功能酶标仪进行定量分析。具体由以下步骤组成：(1)将凋落物去杂后，在55℃-65℃烘箱中迅速烘干并粉碎，过70-80目筛；(2)称取0.08g-0.1g步骤(1)过筛后的粉末，加入0.8mL-1mL体积分数为70％-95％的乙醇溶液，混匀后密封置恒温振荡箱中，在200rpm-300rpm室温条件下振荡3-4小时，然后混合物避光培养12-16h；(3)将培养后的混合物置高速离心机中，10000rpm-12000rpm条件下离心12min-16min，上清液移至新试管中，密封4℃避光保存待用；(4)吸取10μL-15μL步骤(3)得到的上清液至酶标孔板上，加入200μL-300μL质量分数为1.5％-2.5％的Na2CO3溶液，混匀后室温反应4-6min，然后加入10μL-15μL体积分数为45％-55％的Folin–Ciocalteu试剂，混匀后室温静置25-35min，然后将酶标孔板用多功能酶标仪在OD650nm-OD760nm处测光吸收值，以不加粉末作为空白对照；(5)通过标准曲线推定凋落物中总多酚的含量。进一步的，所述步骤(3)得到的上清液0-3天内进行步骤(4)的操作。进一步的，标准曲线测定方法为：精确称取干燥至恒重的没食子酸对照品0.1g，置于棕色烧杯中加蒸馏水溶解后置入100mL棕色容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，得到浓度为1mg/mL的对照品溶液。分别精确吸取没食子酸对照品溶液0、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mL置于5mL棕色容量瓶中,各加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，从中精密吸取10μL-15μL上述溶液至酶标孔板上，加入200μL-300μL质量分数为1.5％-2.5％的Na2CO3溶液，混匀后室温反应4-6min，然后加入10μL-15μL体积分数为45％-55％的Folin–Ciocalteu试剂，混匀后室温静置25-35min，然后用多功能酶标仪测定OD650nm-OD760nm处光吸收值，以吸光值为纵坐标，浓度(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线。一种上述总多酚含量的测定方法的用途为用于测定森林凋落物中总多酚的含量。本专利技术优化了总多酚，特别是凋落物中总多酚含量的测定条件，包括浸提溶液浓度及用量、浸提时间、碱液浓度及用量、Folin–Ciocalteu试剂浓度及用量、反应温度及时间、比色装置、检测波长等因素，建立了Folin–Ciocalteu法测定凋落物中总多酚含量的适宜条件。本专利技术在前处理中使用0.5mL-1mL体积分数为70％-95％的乙醇溶液作为多酚化合物的浸提溶液，并振荡浸提3-4小时，该浓度及体积的乙醇溶液能很好的将多酚化合物浸提出，且方法简便易行，结果准确，重现性和稳定性好。本专利技术的显色体系设定在酶标孔板上，所用样品量及试剂量少，用移液枪即可准确吸取，也有利于后期的快速检测，同时能极大的节约实验成本，缩短测定时间。本专利技术测定光吸收值时采用多功能酶标仪，稳定性高，且极大的提高了准确度和精密度，缩短了测定时间。本专利技术选择亚热带森林中丰富度较高、具有代表性的森林凋落物为测试样品，运用本专利技术涉及的检测方法对各样品总多酚含量进行了测定，与高锰酸钾法、普鲁士蓝法、酒石酸亚铁法相比，误差较小，稳定性和精准度得到极大提高，特别是前处理步骤采用乙醇溶液浸提，破坏性小，提取充分，且操作便捷，适于大规模样本的定量分析。与需衍生化处理的色谱分析法相比，实验方法及步骤简便易行，成本低廉,重现性高。附图说明图1是实施例1的标准曲线图；图2是实施例2的标准曲线图；图3是实施例3的标准曲线图；图4是实施例4的标准曲线图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：一种凋落物中总多酚含量的测定方法，采用乙醇溶液进行前处理，以Folin–Ciocalteu试剂将被测物质定量氧化，最后采用多功能酶标仪进行定量分析。由以下步骤组成：(1)将凋落物去杂后，在55℃烘箱中迅速烘干并粉碎，过70目筛；(2)称取0.08g步骤(1)过筛后的粉末，加入0.8mL体积分数为70％的乙醇溶液，混合均匀后密封置恒温振荡箱中，在250rpm本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种凋落物中总多酚含量的测定方法，其特征在于：采用乙醇溶液进行前处理，离心后以Folin–Ciocalteu试剂作为氧化剂将被测物质定量氧化，最后采用多功能酶标仪进行定量分析。

【技术特征摘要】
1.一种凋落物中总多酚含量的测定方法，其特征在于：采用乙醇溶液进行前处理，离心后以Folin–Ciocalteu试剂作为氧化剂将被测物质定量氧化，最后采用多功能酶标仪进行定量分析。2.如权利要求1所述的一种凋落物中总多酚含量的测定方法，其特征在于由以下步骤组成：(1)将凋落物去杂后，在55℃-65℃烘箱中迅速烘干并粉碎，过70-80目筛；(2)称取0.08g-0.1g步骤(1)过筛后的粉末，加入0.8mL-1mL体积分数为70％-95％的乙醇溶液，混匀后密封置恒温振荡箱中，在200rpm-300rpm室温条件下振荡3-4小时，然后混合物避光培养12-16h；(3)将培养后的混合物置高速离心机中，10000rpm-12000rpm条件下离心12min-16min，上清液移至新试管中，密封4℃避光保存待用；(4)吸取10μL-15μL步骤(3)得到的上清液至酶标孔板上，加入200μL-300μL质量分数为1.5％-2.5％的Na2CO3溶液，混匀后室温反应4-6min，然后加入10μL-15μL体积分数为45％-55％的Folin–Ciocalteu试剂，混匀后室温静置25-35min，然后将酶标孔板用多功能酶标仪在OD650nm-OD760nm处测光吸收值，以不加粉末作为...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕艳娜，唐金宝，蒲高忠，
申请(专利权)人：潍坊医学院，
类型：发明
国别省市：山东;37