用于免疫治疗的基于酵母的疫苗制造技术

描述了一种治疗和／或预防多种适用于免疫疗法的疾病和状态的组合物和方法，在一个具体实施例中，描述了治疗和／或预防动物癌症的组合物和方法。揭示了涉及如以下内容的具体改进：含有酵母载体和选择用来诱发动物的抗原特异性细胞免疫反应和体液免疫反应的抗原的基于酵母的疫苗，在用于预防性和／或治疗性免疫接种以及预防和／或治疗多种疾病和状态中的用途。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及含有异源抗原的基于酵母的疫苗在诱发体液免疫和细胞免疫，和一方面预防和治疗多种动物癌症中的用途。
技术介绍
导致新的、异常生长的瘤形成或快速细胞增殖过程是许多疾病的特征，这些疾病可能是严重的，并且有时是威胁生命的。通常，细胞和组织的瘤性生长以高于细胞的正常增殖为特征，其中即使诱发(instigating)因子(例如，肿瘤启动子，致癌原，病毒)不再存在之后，细胞仍然继续生长。细胞生长往往显示出结构上缺乏组织和/或缺乏与正常组织的协调，并且通常产生一团可能是良性或恶性的组织(例如，肿瘤)。恶性细胞生长，或恶性肿瘤是世界范围内死亡的最主要的原因，研发肿瘤性疾病的有效治疗方法是大体研究的课题。虽然已经提出了多种治疗和预防癌症的创新方法，很多癌症仍然具有高死亡率，并且可能难以治疗或者对于常规疗法相对无反应。例如，肺癌是美国第二种最普遍的癌症形式，占全部癌症的15%和全部癌症死亡数的观％。2002年，估计将诊断出177，000例肺癌新增病例，166，000人将死亡，死亡率高于结肠直肠癌、前列腺癌和乳腺癌的总和。80%的原发性肺部肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)。 由于多种药物治疗产生最小存活优势和严重毒性，标准化疗联合仍然是相对无效的。另有一例，多形性成胶质细胞瘤(神经胶质瘤)是成年人中最普遍的原发恶性脑肿瘤。尽管应用了外科手术，放疗和化疗，治愈率和平均患者存活数仍没有改善。其它肿瘤也向脑部转移，这种情况下，由于血脑屏障对药物传递的限制使它们对外周化疗的反应不太好。明确地说，需要更多的针对脑肿瘤的治疗方法。这种方法的其中之一包括免疫疗法。 一段时间以来已知在外周致敏了的淋巴细胞能通过血脑屏障并靶向脑组织。脑肿瘤免疫疗法的主要靶点是诱发针对在脑肿瘤细胞中特异性表达的新的或突变的抗原的免疫反应的疫苗。这个目标将提供一种疫苗方法，以提供广泛的、有力的和长效的免疫保护作用对抗颅内肿瘤。疫苗广泛地用于预防疾病和治疗确定的疾病(免疫治疗疫苗)。蛋白抗原(例如， 由于重组DNA技术使其研制成为可能的亚单位疫苗)，当不与佐剂一起给予时，诱发弱体液 (抗体)免疫，并因此到目前为止是令人失望的，因为它们仅产生有限的免疫原性。亚单位疫苗与灭活病毒和重组活病毒疫苗的另一个缺点是当与佐剂一起给予时，虽然刺激强体液免疫反应，但不能诱发保护性细胞免疫。佐剂实验性地用来刺激小鼠的有效免疫反应，并且希望用于人疫苗，但只有少数佐剂被批准用于人类应用。实际上，在美国批准使用的唯一佐剂是铝盐，氢氧化铝和磷酸铝，它们中没有一个刺激细胞介导的免疫。铝盐制剂不能冷冻或冻干，并且这种佐剂不是与所有抗原都有效。另外，多数佐剂不会导致细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的诱导。CTL是杀死合成异常蛋白，包括病毒蛋白和突变“自身”蛋白的细胞所需的。 正在大力研究刺激CTL的疫苗以用于对抗多种疾病，包括所有癌症(例如黑色素瘤，前列腺癌，卵巢癌等)。因此总之需要总体刺激CTL和细胞介导免疫的佐剂。酵母已用于亚单位蛋白疫苗的产生；然而，在这种情况中，酵母用于产生蛋白，但是酵母细胞或其亚细胞级分实际上不能传递给患者。也有在免疫之前用酵母喂饲动物，试图以非特异性方式启动免疫反应(例如，刺激吞噬作用以及补体和干扰素的产生)。结论是不明确的，并且这种方法不能产生保护性细胞免疫；参见例如i^attal-German等，1992， Dev. Biol. Stand. 77，115-120 ；Bizzini 等，1990，FEMSMicrobiol. Immunol. 2，155-167。1998年11月3日公布的Duke等人的美国专利US 5，830，463，描述了使用带有至少一个能调节免疫反应的化合物的非致病性酵母，并证明了这种复合物对刺激细胞介导的免疫和刺激体液免疫都有效。具体的，US 5，830，463证明了当给予动物后，经遗传改造表达异源抗原的酵母能诱发细胞介导的免疫反应和体液免疫反应。尽管癌症治疗和疫苗技术目前有进展，仍然急迫需要研制安全和有效的疫苗和佐剂，它们是针对适用于免疫疗法的疾病，包括瘤性转化(癌)导致的疾病，特别是针对那些对使用常规癌症疗法和普通疫苗策略的治疗特别耐受的癌症。专利技术概述本专利技术的一个实施例涉及一种保护动物对抗癌症的方法，包括对已患有癌症或可能发展为癌症的动物给予疫苗，以减少或预防动物癌症的至少一种症状。所述疫苗包含 (a)酵母载体；和(b)酵母载体表达的融合蛋白，所述融合蛋白包含⑴至少一种癌抗原； 和(ii)与该癌抗原N-末端连接的肽，所述肽由至少两个与癌抗原异源的氨基酸残基组成， 且所述肽能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后加工。融合蛋白要满足下述额外要求(1)融合蛋白位置1的氨基酸残基是甲硫氨酸；(2)融合蛋白位置2的氨基酸残基不是甘氨酸或脯氨酸；(3)融合蛋白位置2-6的氨基酸残基都不是甲硫氨酸；和(4)融合蛋白位置2-5的氨基酸残基都不是赖氨酸或精氨酸。一方面，所述肽由至少2-6个与癌抗原异源的氨基酸残基组成。另一方面，所述肽包含M-X2-X3-X4-X5-Xe的氨基酸序列，其中\是除甘氨酸，脯氨酸，赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸A3是除甲硫氨酸，赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸是除甲硫氨酸，赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸A5是除甲硫氨酸，赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸；和&是除甲硫氨酸之外的任意一种氨基酸。一方面J6是脯氨酸。另一方面，所述肽包含M-A-D-E-A-P (SEQ ID NO 1)的氨基酸序列。本专利技术的另一个实施例涉及一种保护动物对抗癌症的方法，包括对已患有癌症或可能发展为癌症的动物给予疫苗，以减少或预防动物癌症的至少一种症状。所述疫苗包含 (a)酵母载体；和(b)酵母载体表达的融合蛋白，所述融合蛋白包含(i)至少一种癌抗原； 和(ii)与该癌抗原N-末端连接的酵母蛋白，其中酵母蛋白由内源酵母蛋白的约2个至约 200个氨基酸组成，且所述酵母蛋白能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后加工。一方面，所述酵母蛋白包含用于鉴定和纯化融合蛋白的抗体表位。上述任意一个本专利技术的实施例，还要考虑下述额外方面。一方面，融合蛋白包含至少两种或多种癌抗原。另一方面，融合蛋白包含一种或多种癌抗原的至少一个或多个免疫原性功能域。另一方面，癌抗原是与选自以下组癌症相关的抗原黑色素瘤，鳞状细胞癌，乳腺癌，头颈癌，甲状腺癌，软组织肉瘤，骨肉瘤，睾丸癌，前列腺癌，卵巢癌，膀胱癌，皮肤癌， 脑癌，脉管肉瘤(angiosarcoma)，血管肉瘤(hemangiosarcoma)，肥大细胞肿瘤，原发性肝癌，肺癌，胰腺癌，胃肠癌，肾细胞癌，造血细胞瘤形成及它们的转移性癌症。另一方面，癌抗原是ras基因编码的野生型或突变蛋白。例如，癌抗原可包括选自以下组的ras基因编码的野生型或突变蛋白K-ras，N-ras和H-ras基因。一方面，ras基因编码带有单突变或多突变的Ras蛋白。另一方面，癌抗原包含片段，所述片段含有对应于野生型Ras蛋白位置12，13，59或61的氨基酸的野生型Ras蛋白的至少5_9个连续氨基酸残基，其中位置12，13，59，或61的氨基酸残基相对于野生型Ras蛋白发本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于保护动物对抗癌症的治疗性组合物，其包含：ａ）酵母载体；和ｂ）由该酵母载体表达的Ｒａｓ抗原，所述Ｒａｓ抗原选自：ｉ）融合蛋白，包含以下氨基酸序列：（１）含有野生型Ｒａｓ蛋白的位置５７－６５、且与野生型Ｒａｓ蛋白相比位置６１的谷氨酰胺已突变的氨基酸序列，所述野生型Ｒａｓ蛋白具有氨基酸序列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１或ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３；（２）含有野生型Ｒａｓ蛋白的位置８－１６、且与野生型Ｒａｓ蛋白相比位置１２的甘氨酸已突变的氨基酸序列，所述野生型Ｒａｓ蛋白具有氨基酸序列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１或ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３；和（３）含有野生型Ｒａｓ蛋白的位置５７－６５、且与野生型Ｒａｓ蛋白相比位置６１的谷氨酰胺已突变的氨基酸序列，所述野生型Ｒａｓ蛋白具有氨基酸序列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１或ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３；和ｉｉ）突变的Ｒａｓ蛋白，其与野生型Ｒａｓ蛋白相比，位置１２的甘氨酸和／或位置６１的谷氨酰胺已突变，所述野生型Ｒａｓ蛋白具有氨基酸序列ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：３、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１或ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：１３。...

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：亚历克斯弗兰朱索夫，
申请(专利权)人：全球免疫股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US