使用酵母表面展示载体筛选具有改良的酶活性的脂肪酶的方法和该脂肪酶技术

本发明专利技术涉及使用酵母表面展示载体筛选具有改良的酶活性的脂肪酶的方法和通过该方法制备的该突变脂肪酶，更具体地涉及包含：１）将脂肪酶基因克隆到表面展示载体中，２）通过诱变ＰＣＲ制备步骤１的脂肪酶的突变基因文库，３）将步骤２的突变脂肪酶基因文库和表面展示载体转化到宿主细胞中，和４）测量在转化的宿主细胞的表面展示的突变脂肪酶的活性并选择如此制备的突变脂肪酶的方法。本发明专利技术的方法可筛选具有改良的酶活性的脂肪酶。因此，其可有效用于各种领域，如食品和洗涤剂工业。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及使用酵母表面展示载体筛选具有改良的酶活性的脂肪酶的方法和通过该方法制备的该突变脂肪酶，更具体地涉及包含1)将脂肪酶基因克隆到表面展示载体中，2)通过诱变PCR制备步骤1的脂肪酶的突变基因文库，3)将步骤2的突变脂肪酶基因文库和表面展示载体转化到宿主细胞中，和4)测量在转化的宿主细胞的表面展示的突变脂肪酶的活性并选择具有进化的活性的突变脂肪酶的方法，和通过该方法制备的突变脂肪酶。
技术介绍
脂肪酶是羧酸酯水解酶并且广泛用于食品和表面活性剂工业以及各种手性化合物的合成。在许多来源于微生物的脂肪酶中，来自南极洲假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶B(此后称为“CALB”)由317个氨基酸组成并且形成α/β水解酶的形式。CALB由于能够特异地光学转化仲醇和仲胺(Rotticci等，Chembiochem.，2001，2，766)而在光学异构体的选择中和聚酯的合成中非常重要(Anderson等，Biocatal.Biotransform.，1998，16，181)，并且可以用于医学供应品和农业化学品的各种生产中。最近，关于在单细胞生物如酵母、细菌(包括噬菌体)等的细胞表面表达外源蛋白的研究已经在活跃地进行并且用于产生新疫苗、筛选抗原和抗体、将有用的酶固定到细胞表面上，等等。例如，已经使用一种酵母(酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae)进行了细胞表面上蛋白质表达的研究。通过利用高等真核细胞的胞内分泌系统，该酵母诱导了在培养基中分泌有用的外源蛋白而不损失其活性，这使得该酵母是作为通过遗传重组技术生产重要外源蛋白的宿主细胞的有用候选者。一种众所周知的细胞壁蛋白--α-凝集素已经成为酵母的表面表达的主要靶标(Schreuder等，Yeast.，1993，9，399)。由于α-凝集素或其他细胞壁蛋白，各种酶如α-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、脂肪酶、角质酶等可以在细胞表面上稳定地表达。此外，根据最近报导，通过在细胞中同时表达各种酶使得工业有效的生物催化剂的开发得以实现(Murai等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，1999，51，65)。到今天为止，通过破碎细胞、分离所表达的酶，并将酶固定在载体上或者用渗透溶剂如甲苯处理，已经制备了用于生产食品或医学供给品的用于生物转化的微生物来源的生物催化剂。但是这些方法因为高成本和酶的失活而具有低生产率的问题。最近，已经进行了使用酿酒酵母的筛选方法的研究，该酿酒酵母适于在细胞表面表达靶蛋白。作为一种真核细胞，酵母具有类似于高等动物的蛋白质合成过程，并且具有通过FACS(荧光激活细胞分选仪)的细胞选择的足够大小，FACS可以辨别具有微小差异的细胞(VanAntwerp和Wittrup.，Biotechnol.Prog.，2000，16，31)。使用酵母表达系统，可以简化基因和文库构建的操作。而且，可以克服表达水平的差异。还可能通过用表面展示系统筛选，选择最适合表面表达的酶。用该方法选择的酶可以极大地增加表面表达的酶的用途。已经多次报导用FACS筛选展示具有增强的亲和力的抗体、抗原或T-细胞受体的酵母菌株(Schreuder等，Vaccine.，1996，14，383，Kieke等，Protein.Eng.，1997，10，1303，Kieke等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，1999，96，5651)，然而还没有报导展示具有提高活性的酶的株系的筛选。到目前为止只报导了使用来自假单胞菌变种(Pseudomonas sp)的冰晶核蛋白通过表面展示系统筛选具有提高的活性的羧甲基纤维素酶的情况(Kim等，Appl. Environ.Microbiol.，2000，66，788)。本专利技术人从工业酵母多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)分离了新的细胞壁粘附-介导蛋白并使用其开发了在细胞表面表达靶蛋白的新的表面展示系统(PCT/KR00/00819)。多形汉逊酵母是具有强诱导型启动子的工业有效菌株，其在高温和有机溶剂中都具有稳定性，生长快并且可以极好地产生外源重组蛋白。因此，该菌株非常适于生物反应系统和诸如脂肪酶的酶的生产。为了大量产生脂肪酶——一种有用的生物催化剂，本专利技术人已经使用在细胞表面表达靶蛋白的表面表达系统(PCT/KR00/00819)构建了南极洲假丝酵母脂肪酶B突变文库，并且已经从该文库选择了具有极好脂肪酶活性的突变菌株，并通过开发从该酵母菌株大量生产突变脂肪酶蛋白的新方法，最终完成了该专利技术。优选实施方案详述本专利技术提供了筛选具有改良的酶活性的突变脂肪酶的方法，该方法包含以下步骤1)将脂肪酶基因克隆到表面展示载体中，2)通过诱变PCR，使用步骤1的表达载体中的脂肪酶基因作为模板，制备突变脂肪酶基因文库，3)将步骤2的突变脂肪酶基因文库和表面展示载体转化到宿主细胞中，和4)测量所转化的宿主细胞的表面中展示的突变脂肪酶的活性并从突变库(pool)中选择具有改良的活性的脂肪酶。本专利技术还提供了通过本专利技术的筛选方法制备的突变脂肪酶蛋白，其中，SEQ.ID.No 14表示的南极洲假丝酵母脂肪酶B的#219亮氨酸和/或#278亮氨酸被其他氨基酸代替。本专利技术还提供了编码突变的脂肪酶蛋白的基因。本专利技术还提供了含有以上基因的表达载体。本专利技术还提供了其中导入了上述表达载体的转化体。本专利技术还提供了通过培养上述转化体生产突变脂肪酶蛋白的方法。本专利技术的其他特征将在下文出现。本专利技术涉及筛选具有改良的酶活性的突变脂肪酶的方法，该方法包括下列步骤1)将脂肪酶基因克隆到表面展示载体中；2)通过诱变PCR，使用步骤1的表面展示载体中的脂肪酶基因作为模板，制备突变脂肪酶基因文库；3)将步骤2的突变脂肪酶基因文库和表面展示载体转化到宿主细胞中；和4)测量所转化的宿主细胞的表面中展示的突变脂肪酶的活性并从突变库中选择具有改良的活性的脂肪酶。本专利技术中“表面展示载体”指在细胞表面上稳定表达外源蛋白的载体。在本专利技术中，SEQ.ID.No 14所表示的并且来自南极洲假丝酵母的南极洲假丝酵母脂肪酶B优选被用于克隆到表面展示载体中。用于本专利技术筛选的表面展示载体是在转化体的表面表达外源蛋白质的载体并且其特征在于包括启动子基因、编码分泌信号序列的基因、脂肪酶基因或突变的脂肪酶基因、表面展示介导基因和终止子基因。优选从GAPDH、PGK、ADH、PHO5、GAL1、GAL10、SED1、MOX、TEF和TPI中选择启动子基因，从Mfα、PHO6、SUC2、AMY、SED和杀伤毒素(killer toxin)中选择编码分泌信号序列的基因，从SED1、PIR2、TIP1、CWP1、GAS1和WSC1中选择表面展示介导基因——可以在细胞表面表达脂肪酶的一种因子，但是并不总是限于此。作为用于本专利技术中筛选方法的步骤3中的转染的宿主细胞，可以选择酵母如假丝酵母属(candida)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、Yarrowia和酵母(Saccharomyces)属本文档来自技高网...

【技术保护点】
筛选具有改良的酶活性的突变脂肪酶的方法，该方法包括下列步骤：１）将脂肪酶基因克隆到表面展示载体中；２）通过诱变ＰＣＲ，使用步骤１的表面展示载体中的脂肪酶基因作为模板，制备突变脂肪酶基因文库；３）将步骤２的突变脂肪酶基 因文库和表面展示载体片段转化到宿主细胞中；和４）测量所转化的宿主细胞的表面中展示的突变脂肪酶的活性并选择显示进化的活性的脂肪酶。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：崔毅星，孙廷薰，金素影，
申请(专利权)人：韩国生命工学研究院，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]