本发明专利技术通过扩增斯达氏油脂酵母果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因组DNA上下游序列，进行生物学信息分析和功能验证，获得可广泛用于产油酵母中油脂酵母属(Lipomyces)及丝孢酵母属(Trichosporon)中基因表达、遗传工程操作和菌株改良的启动子和终止子，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。本发明专利技术还涉及含有这些元件的DNA表达盒或重组载体，及利用相关元件构建油脂酵母属或丝孢酵母属基因工程菌株的方法及相应的菌株。
【技术实现步骤摘要】
果糖-1,6-二磷酸醛缩酶启动子和终止子及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及斯达氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)的启动子终止子及其用途，包括基因工程菌株构建所必需的转化方法等。
技术介绍
微生物是自然界中分布最广泛的物种之一，具有卓越的生物合成能力，几乎能合成地球上所有的有机化学品。与多细胞生物相比，微生物的代谢途径虽然相对简单，但其化合物的生产高效、快捷，具有反应条件温和、可控性强、易于大规模生产等特点，可作为一个优良的细胞工厂。自然界中一部分微生物在特定条件下(如氮源缺乏)能在胞内贮存超过其细胞干重20％的油脂，其中以甘油三酯为主，具有这种表型的微生物称为产油微生物，包括细菌、酵母、霉菌、藻类等，其中产油酵母包括Lipomyces，Trichosporon，Rhodotorula，Candida，Cryptococcu和Yarrowia属中的某些菌株(Ratledge，C.andWynn，J.P.AdvApplMicrobiol，2002，51，1-51.)。利用微生物转化生物质资源生产油脂，可发展成基本不依赖耕地、可连续生产、降低农业污染、资源综合利用的新技术，是形成化学品的石化资源替代品新的生产途径(赵宗保.中国生物工程杂志，2005，25，8-11.)。然而完全依赖于这些菌株固有的代谢途径，生产强度及性能往往达不到工业化要求。利用基因工程技术进一步优化或改变它们的代谢网络和表达调控网络，加快生物基产品的积累速度或定向控制靶产品的种类，是构建优良工业化应用菌株的重要途径之一。虽然对于一些常规酵母的基因工程改造已经较为成熟(Alper，H.，andStephanopoulos，G.NatRevMicrobiol，2009，7，715-723.)，但是对于这些非常规油脂酵母的遗传操作尚处于起步状态，许多酵母没有合适的基因操作平台。开发合适的基因操作方法，对于这些非常规微生物的应用意义重大。油脂酵母属(Lipomyces)中的斯达氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)是一株优良的产油酵母，它可以积累超过细胞干重60％以上的油脂(Zhao，X.，Kong，X.L.，Hua，Y.Y.，etal.EurJLipidSciTech，2008，110，405-412.)。它不仅具有底物利用范围广(Angerbauer，C.，Siebenhofer，M.，Mittelbach，M.，etal.BioresourTechnol，2008，99，3051-3056；Liu，J.X.，Yue，Q.Y.，Gao，B.Y，etal.BioresourTechnol，2012，106，69-73.)，可调控性强等特点(武双.，华艳艳.，仲崇斌等.微生物学通报，2008，35，200-203.)，还能够降解和利用除草剂等有毒物质(Nishimura，K.，Yamamoto，M.，Nakagomi，T.，etal.ApplMicrobiolBiot，2002，58，848-852.)，是一株具有良好工业应用前景的菌株。但是至今为止，未见适合于斯达氏油脂酵母的启动子序列报道，也未见适用于斯达氏油脂酵母的遗传操作系统，这些都制约了靶向性的菌株改造。丝孢酵母属(Trichosporon)中的皮状丝孢酵母(Trichosporoncutaneum)一般在一些工业废水、含酚类物质的废液及炼油厂附近被发现，具有很强的酚类化合物分解能力及重金属吸附能力(Anderson，J.J.，andDagley，S.JBacteriol，1980，141，534-543；Yotova，L.，Tzibranska，I.，Tileva，F.，etal.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，2009，36，367-372.)；底物利用范围广(袁锦云，艾佐佐，张志斌，etal.生物工程学报，2011，27，453-460.)，同时能够同步利用五碳糖和六碳糖积累超过自身重量40％以上的油脂(Hu，C.，Wu，S.，Wang，Q.，etal.BiotechnolBiofuels，2011，4，25.)。并且从其中分离出来的一些工业用酶，如一氧化氮还原酶(Zhang，L.，Takaya，N.，Kitazume，T.，etal.EurJBiochem，2001，268，3198-3204.)，木聚糖酶(Liu，W.，Zhu，W.M.，Lu，Y.L.，etal.ProcessBiochem，1998，33，331-336.)等暗示着这类菌株良好的工业应用潜力。但是至今为止，未见适合于皮状丝孢酵母的启动子序列报道，也未见适用于斯达氏油脂酵母的内源启动子，这些都制约了靶向性的菌株改造。虽然曾有人分离圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶启动子用于自身的基因工程操作(ZL2010101897232)，但未见该启动子用于皮状丝孢酵母，以及担子菌门外其它特种比如子囊菌门斯达氏油脂酵母等基因工程操作的报道。然而，启动子对于遗传操作系统来说必不可少。因此，分离能够在斯达氏油脂酵母和皮状丝孢酵母中启动报告基因表达的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶启动子成为目前研究的焦点。
技术实现思路
鉴于上述现有技术瓶颈，本专利技术的主要目的是提供可通用于斯达氏油脂酵母或皮状丝孢酵母中外源基因表达的启动子和终止子，及采用合适的转化技术对这两类酵母菌种进行改良的方法。为实现本专利技术的目的，本专利技术人通过对斯达氏油脂酵母的基因组序列进行分析，获得糖酵解代谢途径的关键酶——果糖-1，6-二磷酸醛缩酶的DNA序列，并进一步通过PCR技术从斯达氏油脂酵母染色体DNA中成功分离了包含有效启动子的DNA片段，采用合适的转化方法将含有果糖-1，6-二磷酸醛缩酶启动子pLsFBA的外源DNA片段分别导入斯达氏油脂酵母或皮状丝孢酵母中，成功实现了外源基因的表达，完成了本专利技术。本专利技术成功分离了能够在斯达氏油脂酵母和皮状丝孢酵母中启动报告基因表达的斯达氏油脂酵母果糖-1，6-二磷酸醛缩酶启动子，并构建了其表达载体。具体讲，本专利技术包含下述实施方案(A)到(H)：(A)本专利技术涉及一种具有斯达氏油脂酵母或皮状丝孢酵母转录启动子活性的DNA片段，所述DNA片段：(1)具有如SEQIDNO：1所示DNA序列的全部序列或包含该DNA序列自3’-末端起1500bp以内的部分序列，(2)具有可与如SEQIDNO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起1500bp以内的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，或(3)对SEQIDNO：1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQIDNO：1所示序列具有50％以上同源性、且具有启动子活性的序列。(B)本专利技术涉及一种来自斯达氏油脂酵母的DNA片段，所述DNA片段可作为终止子，并且：(1)具有如SEQIDNO：2所示的DNA序列的全部或包含该DNA序列5’-末端的部分序列；或(2)具有可与如(1)所示序列杂交的、且保持如(1)所述序列活性的序列。(C)本专利技术涉及一种可完成靶基因在斯达氏油脂酵母或皮状丝孢酵母中转录起始和转录终止的DNA分子，它具有上述本文档来自技高网...
【技术保护点】
果糖‑1，6‑二磷酸醛缩酶启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.果糖-1，6-二磷酸醛缩酶启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种DNA表达盒，其含有SEQIDNO：1所示的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶启动子的核苷酸序列。3.权利要求2所述的表达盒，其还含有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列作为终止子，其中SEQIDNO：1所示的序列位于SEQIDNO：2所示的序列的上游，SEQIDNO：1和SEQIDNO：2之间为编码目的基因的开放阅读框架。4.权利要求3所述的DNA表达盒，其特征在于：所述编码目的基因的开放阅读框架的cDNA序列如SEQIDNO：4所示。5.一种包含权利要求2-4中任一项所述的DNA表达盒的重组载体。6.权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述载体为游离型或者整合型载体。7.权利要求6所述的重组载体，其中所述游离型载体选自大肠杆菌克隆载体或酵母穿梭载体。8.权利要求7所述的重组载体，其中所述游离型载体选自pMD18-T、pUC18、pYES2c/t或pYX212。9.权利要求6所述的重组载体，其中所述整合型载体为农杆菌介导的双元表达载体，或者为携带有靶基因翼侧1500-4000碱基同源重组臂的同源重组载体。10.权利要求9所述的重组载体，其中所述农杆菌介导的双元表达载体选自pZPK或pPZP200，其中所述pZPK通过用卡那霉素抗性基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵宗保，林心萍，张素芳，王雪颖，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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