肝脏炎症的生物标志物制造技术

本发明专利技术涉及对来自人的生物样品进行诊断研究的方法，用于诊断研究肝脏炎症，尤其是肝脏纤维化和／或肝硬变，其中所述样品被研究作为肝脏炎症－－尤其是肝脏纤维化和／或肝硬变的标志物的一种或多种蛋白质，其中相对于健康状况，所述蛋白质浓度升高或者降低表明存在肝脏炎症，尤其是肝脏纤维化和／或肝硬化。所述蛋白质选自：ＥＲ６Ｑ、波形蛋白、肌动蛋白α１骨骼肌蛋白、ｈＭＦＡＰ　４、原肌球蛋白、ＰＴＧＥＳ　２、淀粉样Ｐ－组分、ｔｒａｎｓｇｅｌｉｎ、钙调理蛋白１、人ｐ２０蛋白、１７ｋＤａ肌球蛋白轻链、Ｈ链Ｈ　Ｉｇｇ　Ｂ１２、脯氨酰４－羟化酶、β亚基亚甲基四氢叶酸脱氢酶１、ＰＲＯ２６１９、醛脱氢酶１、纤维蛋白原α链前蛋白原、果糖－二磷酸－醛缩酶Ｂ、精氨酸琥珀酸合成酶、Ｅｅｆｌａ２、ＡＴＰ　５　Ａ１、α－２－肌动蛋白、调钙素、血清白蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、线粒体乙酰乙酰辅酶Ａ硫解酶、或者在每一情况下，是其部分序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肝脏炎症的生物标志物本专利技术涉及一种用于人类肝脏炎症的生物样品的诊断研究的方 法，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变，样品被研究因为一种或多种蛋白 质作为肝脏炎症的标记物，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变，蛋白质的 浓度相对于健康状况提高或降低，这表明肝脏存在炎症，尤其是肝脏 纤维化和/或肝硬变中。全世界大约有1.7亿人慢性感染了丙型肝炎病毒(hepatitis C virus (HCV))。病人之间疾病的病程显著不同；虽然大约20%的病人 在20年内发展为肝硬化，而在其它病人中，在更长的时间期间后，仍 然没有观察到这一类型的发展。除了其它因素之外，可确定会增加肝 脏纤维化和/或肝硬变概率的一批因素有，雄性、酒精滥用、HIV或曼 氏血吸虫(ScA/Wc^o迈a则/2so/z/)的共感染、遗传易感性和感染时年 龄较大。最重要的是，肝星状细胞(hepatic stellate cells (HSC)), 其在休息状态下在正常肝脏中负责维生素A的储存，尤其是，负责肝 脏纤维化和/或肝硬变的发展。相反，在纤维化肝脏中，它们被激活， 增生，且发展为肌纤维母细胞。这些肌成纤维细胞产生大量胶原蛋白， 下调基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases (MMP))的产生， 且显示出腦P的生理才中制剂(physiological inhibitors of the MMP (TIMP))的增加性表达。随着增加胶原蛋白积聚，肝脏的纤维化进一 步发展，这最后可能导致器官功能衰竭。尤其是，聚乙二醇化千扰素oc (peg-interferon alpha)和利巴 韦林(ribavirin (三氮唑核苷))被用于慢性肝炎C的抗病毒治疗。尽管这种方式可以成功地治疗许多病人，但该治疗在至少50%病人中 是不成功的，这些病人感染了 HCV基因型1，这种HCV基因型1在西 方国家是最普遍的。这对感染了 HCV基因型4的病人是类似真实的， 这种HCV基因型4在埃及频繁发生。此外，持久的抗病毒治疗的成本 很高，并且这种治疗与显著的副作用有关。在显著晚期的病人中，抗 病毒治疗不再产生期望的成功。因此，存在对能更好地诊断肝炎病人 的纤维化以及因此而言肝硬化发生的需求，以及能够为治疗医师提供 就抗病毒治疗是否可取以及是否有希望做出决断的能力的需求。过去许多非侵入性标记物已经被用于肝脏纤维化的检测，在这些 非侵入性标记物中，有所谓的acti-test或f ibro-test、 III型前胶 原肽(PIIIP)、透明质酸、基质金属蛋白酶(MMP)以及它们的抑制 剂(TIMP) (T. Poynard等人，^r; e" i er#。/"/a《/2. 2005， J(l): 15 - 21; V. Leroy等人，/ 2001， M (1):26)。然而，所有这 些标记物仅仅表现出有限的敏感性和特异性，由于这个原因，存在对 更合适的标记物的进一步需求。从所描述的现有技术出发，因此它自身提出此种目标，即提供研 究肝脏炎症和/或肝脏纤维化和/或肝硬变的生物样品的改进方法，其 中使用新颖的标记物。根据本专利技术，实现了这样的目标，即通过研究人类生物样品的肝 脏炎症，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变的方法，样品被研究，目标是 一种或多种蛋白质作为肝脏炎症的标记物，尤其是肝脏纤维化和/或肝 硬变，以及升高水平的所述蛋白质表明存在肝脏炎症，尤其是肝脏纤 维化和/或肝硬变，所述蛋白质选自ER60、波形蛋白、肌动蛋白ct 1 骨骼肌蛋白、hMFAP4、原肌球蛋白、PTGES2、淀粉样-P-组分、 transgelin、辨调节蛋白1、人(Homo sapiens) p20蛋白、17 kDa 肌球蛋白轻链、H链H IgG B12、脯氨酰4-羟化酶、P亚基。进一步，本专利技术也涉及一种相应的方法，其中，降低水平的所述 蛋白质表明存在肝脏炎症，尤其是肝脏纤维化和/或肝硬变，在这种情况下，所述蛋白质选自亚甲基四氢叶酸脱氢酶1、 PR02619、醛脱氢 酶l、纤维蛋白原ot-链前蛋白原、果糖-二磷酸-醛缩酶B、精氨酸琥 珀酸合成酶、Eefla2、 ATP5A1、 a-2-肌动蛋白、调钙素、血清白蛋白、 线粒体苹果酸脱氢酶、线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶。对于上调以及下调蛋白，也根据本专利技术，通过确定生物标记物(也 就是标志物蛋白)的部分序列，进行了研究。尤其是，这样的部分 序列优选包括根据本专利技术的生物标志物的60%的氨基酸序列，尤其是 70%和更多，80%和更多，尤其是90至95%。在本专利技术的上下文中，术语肝脏炎症包括任何形式的肝炎，但尤 其是肝脏纤维化，直到肝硬变(关于这些术语，例如，请参考相关的 Pschyrembel， Klinisches W6rterbuch , 260th edition, 2004， Berlin)。根据本专利技术，肝脏纤维化和肝硬 变是优选的。进一步，本专利技术也涉及肝脏炎症的诊断，尤其是肝脏纤维化和/ 或肝硬变，针对待研究的病人实施测定选自如下的至少一种蛋白的确 定ER60、波形蛋白、肌动蛋白ocl骨骼肌蛋白、hMFAP4、原肌球蛋 白、PTGES 2、淀粉样-P-组分、transgelin、钓调节蛋白1、人p20 蛋白、17 kDa肌球蛋白轻链、H链H IgG B12、脯氨酰4-羟化酶、P 亚基、亚甲基四氢叶酸脱氢酶1、 PR02619、醛脱氬酶l、纤维蛋白原 ot-链前蛋白原、果糖二磷酸醛缩酶B、精氨酸琥珀酸合成酶、Eefla2、 ATP5A1、 oc-2-肌动蛋白、调钙素、血清白蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、 线粒体乙酰乙酰辅酶A硫解酶或其各自的部分序列。7进一步，根据本专利技术的这些生物标志物和/或标志物蛋白对于根据 本专利技术的诊断是可能的。与非纤维化组织相比，在纤维化组织的蛋白质组学分析过程中， 所引述的蛋白可被鉴定为潜在的生物标志物。为了该目的，从感染了 丙型肝炎的病人拿出肝脏活组织检查样品。在手工均质器中用裂解緩冲液均质化样品，DNA和其它细胞材料被除去，得到蛋白质浓缩物。 使用染料标记这些蛋白质；使用等电聚焦，使蛋白质在第一个维度经 受2-D聚丙烯酰胺凝胶电泳，在第二个维度经受SDS凝胶电泳。借助 适合该目的的软件，比较纤维化和非纤维化细胞的结果，检测且量化 在纤维化样品中扩大或降低的斑，这是与非纤维化样品相比而言。例 如，来自GE Healthcare的ImageQ醒tTM软件以及该公司的DeCyder 软件可作为执行软件。测量且分析用来标记蛋白质的染料的散发。借助LC-ESI-MS (液相色镨-电喷雾-质谱)完成进一步的分析。首先，借助凝胶中的胰蛋白酶，将蛋白质分解为单一肽片段；其中，在凝胶中，样品在之前已经被分离。借助反相HPLC，将这些片段 彼此分离，并且使用质镨法研究这些片段，以鉴定单一蛋白。当然， 其它合适的质谱法也可用于该目的，如基质辅助激光解析电离飞行时 间质镨(MALDI-TOF-MS)。下述蛋白质能在研究中被鉴定，相对于非纤维化细胞，这些蛋白 在纤维化细胞中被上调(倍数变化正值)或下调(倍数变化负值)上调蛋白:<table>table see original document page 8</本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种方法，所述方法用于研究人肝脏炎症的生物样品，尤其是肝脏纤维化和／或肝硬变，　样品被研究作为肝脏炎症的标志物的一种或多种蛋白质，尤其是肝脏纤维化和／或肝硬变，　相对于健康状况，所述蛋白质浓度增加表明存在肝脏炎症，尤其是肝纤维化 和／或肝硬化，　特征在于：所述蛋白质选自：ＥＲ６０、波形蛋白、肌动蛋白α１骨骼肌蛋白、ｈＭＦＡＰ４、原肌球蛋白、ＰＴＧＥＳ２、淀粉样Ｐ－组分、ｔｒａｎｓｇｅｌｉｎ、钙调理蛋白１、人ｐ２０蛋白、１７ｋＤａ肌球蛋白轻链、Ｈ链ＨＩｇＧ　Ｂ１ ２、脯氨酰４－羟化酶β亚基或其各自的部分序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：沃尔夫施米格尔，本斯西波斯，克里斯蒂安默勒肯，京特克勒佩尔，赫尔穆特E迈耶，巴巴拉斯泰克，凯斯图勒，
申请(专利权)人：凯施蒂勒，沃尔夫施米格尔，本斯西波斯，赫尔穆特E迈耶，芭芭拉西泰克，
类型：发明
国别省市：DE[德国]