筛选ＮＦ－κＢ途径活化的选择性调节剂的方法技术

本发明专利技术涉及筛选ＮＦ－κＢ途径活化的选择性调节剂的方法。本发明专利技术涉及到通过识别和选择调节ＮＥＭＯ和其他蛋白之间相互作用的分子来初步筛选有可能调节（激活或抑制）ＮＦ－κＢ途径活化分子的方法。本发明专利技术同样也涉及到第二次筛选ＮＦ－κＢ途径活化的调节剂（活化剂或抑制剂）的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及识别和选择分子的方法，该分子通过调节NEMO和其他蛋白之间的相 互作用来调节(激活或抑制)NF- κ B途径活化。
技术介绍
核因子- κ B(NF-k B)信号传导是一种涉及各种基本细胞代谢过程包括炎症反 应、肿瘤生成、病毒感染、调节细胞增殖、凋亡以及B和T淋巴细胞的抗原刺激的信号传导 it (Ghosh, 1998, Annu. Rev. Immunol. ；Karin, 1999, J. Biol. Chem. ；Israel, 2000, Trends CellBiol. ； Santoro，2003，EMBO J·)。在哺乳动物细胞中，存在5种二聚体化的NF-κ B家 族成员:RelA、RelB、c_Rel、NF-κ B2/pl00/p52 和 NF-κ Bl/pl05/p50。NF-κ B 的主要的形 式是由Ρ50和RelA亚基组成的异二聚体的转录因子，在静止细胞中，其仍然通过与蛋白抑 制家族成员例如为人们所熟悉的I κ B相结合而被保留在细胞质中。一旦受到一些因子包 括细胞因子TNF-α和白介素-1、内毒素(LPS)、微生物和病毒感染的刺激，促炎症信号就汇 集于经典的I κ B激酶复合物(IKK)，这是由两个激酶亚基IKKa /IKK-I和ΙΚΚβ /IKK-2以 及一个结构性/调节性亚基ΝΕΜΟ/ΙΚΚ-γ组成的蛋白复合物。一旦活化的IKK复合物磷 酸化IkB蛋白，会引发它们的泛素化(ubiquitination，遍在蛋白化)和随后的被蛋白酶 体降解。释放的NF-KB转录因子被移位至细胞核中，启动或上调基因表达。尽管IKKa和 IKKβ呈现出惊人的结构相似性(52%)，但是遗传学研究已经表明它们涉及到激活NF-k B 的两个途径(Pomerantz，2002，Mol Cell)。ΙΚΚβ是负责经典的NF-κ B复合物活化的促炎 症激酶，反之IKK α与NF- κ B诱导激酶(NIK)结合，在非经典的NF- κ B信号传导途径中起 着重要的作用(Senftleben，2001，Science)。IKK α也在角质细胞分化上起着一定的作用， 但是这个过程与其激酶活性无关(Hu，2001，Nature)。NEMO 蛋白(MF-κ B essential modulator，NF-κ B 基本的调节剂)在 NF-κ B 途径 活化中起着关键的作用。NEMO蛋白与IKK复合物的IKK α和ΙΚΚβ蛋白激酶相结合。IKK 激酶经过未知的机制被磷酸化活化，这被认为是NEMO寡聚化的结果(Agou et al. ,2004, J. Biol. Chem.)。NEMO蛋白的存在是IKK活化的基础，因为NEMO缺陷型细胞不能应答于许 多刺激而激活NF- κ B。应答于促炎症刺激而引发IKK活化的生化机制仍然不清楚。已经证明了活化T 环上的两个丝氨酸残基的磷酸化引发了 ΙΚΚβ的活化。但是，引起磷酸化的机制仍然是未 知的。一个可能的机制包括NEMO寡聚化诱导的激酶的构型的改变(Agou et al. ,2004, J. Biol. Chem.)。这种寡聚化状态的改变可能通过反式-自磷酸化的机制而诱导T环的活 it (Zandi, 1997, Cell ；Tang，2003，J· Biol· Chem·)。与IKK活化中的NEMO寡聚化的作用相符合的是，在应答于许多刺激物的NEMO缺 陷型细胞的活化中，最小的寡聚化结构域的突变不能通过基因互补来解救NF-K B。此外， NEMO的强制的寡聚化导致了 IKK复合物的完全活化(Inohara，2000, J. Biol. Chem. ；Poyet, 2000，J，Biol. Chem. ；Poyet, 2001，J. Biol. Chem.)。最近，已经有报道应答于 TNF- α 的 NEMO的憐酸化禾口泛素化(Carter, 2001, J. Biol. Chem. ；Trompouky, 2003, Nature ；Kovalenko, 2003, Nature)。但是，还没有证明这些NEMO的修饰是应答于一些促炎症刺激物IKK复合物 活化的关键步骤。NF- κ B活化的抑制组成了开发抗炎症和抗癌症药物的特别的靶点(May，2000，Science ；Poulaki, 2002, Am J Pathol)。在NF-κ B信号传导途径的许多蛋白作用剂中， IKK复合物代表着用于发现新的特异性NF-K B抑制剂的最有希望的分子靶点之一。为了 使得体内可能的毒性最小化，治疗的成功将极大地依赖于NF- κ B抑制剂阻断活化信号而 不改变NF-K B活性的基础水平的能力。May等人描述了细胞渗透性的肽抑制剂，其通过破 坏组成性的NEMO与IKK激酶的相互作用来特异性地阻断促炎症NF- κ B活化(May，2000, Science ；May, 2002, J. Biol. Chem.)。通过肽的合理的设计改变蛋白的功能而调节蛋白与蛋 白间的相互作用，为新型的治疗性药物的基础研究和开发提供了重要的工具(Souroujon， 1998，NatBiotechnol.)，尤其是呈现可变的并且动态结合特性的信号传导蛋白(Pawson， 2003, Science)。在文献中已经描述了肽调节剂的大量的研究，其中肽通过干扰定位(转移) (Lin, 1995, J. Biol. Chem.)、汇集于受体(Chang，2000，J. Biol. Chem.)、分子内相互作用 (Souroujon, 1998, Nat Biotechnol.)以及寡聚化(Judice, 1997, P. N. Α. S.)来调节蛋白的 功能。在寡聚化中，用不同的肽抑制HIV-lgp4融合蛋白提供了概念上的明确验证(对其综 述见 Chan, 1998，Cell and Eckert，2001，Ann. Rev. Biochem.)。因此，NEMO蛋白是用于发展新的抑制NF- κ B途径的药物的很有希望的靶点，因为 它整合和协同了大多数NF-KB刺激，并且它不是IKB激酶复合物(IKK)的多余的成分。NEMO蛋白的氨基酸序列表明这个蛋白是由几个结构域组成(Agou et al., J.Biol. Chem.，2004b)。简而言之，多肽的N末端部分包含一个大的卷曲螺旋基序 (coiled-coil motif,CCl)并且所有的残基都参与了蛋白质与IKK激酶的相互作用(IKK结 合结构域)。C末端部分(残基250-412)由两个连续的卷曲螺旋基序CC2(残基253-285) 和LZ (残基301-337)、以及蛋白质C末端的极远端的锌指基序所组成，具有作为蛋白质的调 节部分的作用，已经经常有报道其作为结合模板来连接许多上游的信号传导分子或病毒蛋 白(Ghosh,1998，Annu. Rev. Immunol. ；Santoro,2003，EMBO J.)。有趣的是，主要是在分子的这个部分发现了引起色素失调症(IP)和有免疫缺 陷的外胚层发育不良(EDA-ID)的突变(DOffinger5 2001, Nature Gen. ；Zonana，2000， Am. J. Hum. G本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种初步筛选ＮＦ－κＢ途径活化的潜在的调节剂的体外方法，其特征在于，其包括下列的步骤：（ａ）在不存在被测定的物质Ｓ的情况下，将（ｉ）由ＮＥＭＯ的ＣＣ２和ＬＺ区域所组成的肽Ｐ１与（ｉｉ）被标记的或没有被标记的肽Ｐ２，相接触，所述肽Ｐ１是被标记的或没有被标记的，所述肽Ｐ２选自下组：含有ＮＥＭＯ的ＬＺ区域中至少１０个氨基酸残基的肽、含有ＮＥＭＯ的ＮＬＭ区域中至少１０个氨基酸残基的肽、含有ＤＲ－ＮＬＭ的肽、含有ＮＥＭＯ的ＣＣ２和ＬＺ区域的肽、含有ＮＥＭＯ的ＣＣ２区域中至少１０个氨基酸残基的肽、以及含有由Ｋ６３联接的多聚泛蛋白化链的肽；（ｂ）在有被测定的物质Ｓ存在的情况下，将被标记的或没有被标记的所述肽Ｐ１与被标记的或没有被标记的所述肽Ｐ２相接触；（ｃ）通过测定合适的信号来检测步骤（ａ）中得到的Ｐ１与Ｐ２之间形成的复合物；（ｄ）通过测定合适的信号来检测步骤（ｂ）中得到的Ｐ１与Ｐ２之间形成的复合物；（ｅ）比较（ｃ）中检测的信号与（ｄ）中检测的信号，并且选择（ｃ）中检测的信号／（ｄ）中检测的信号的比值不等于１的物质Ｓ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：法布里斯阿古，让娜基亚拉瓦利，伊夫玛丽夸克，弗朗索瓦巴勒克斯，阿兰伊斯拉埃尔，米歇尔韦龙，
申请(专利权)人：巴斯德研究所，法国国家科学研究中心，
类型：发明
国别省市：FR[法国]