利用包含体干重的蛋白测量制造技术

本发明专利技术涉及用于有效制备重组蛋白的改良方法。更具体地，本发明专利技术涉及一种方法，该方法用于在大规模制备重组蛋白的重折叠步骤前计算包含体中的蛋白，从而提高重折叠步骤的效率、总产量和样品蛋白的质量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及基于包含体采集物的干重来测定重组蛋白制备中的蛋白产物的方法。
技术介绍
在诸如大肠杆菌(E. coli)的细菌中产生的重组蛋白的高水平表达往往导致在细 菌细胞内形成称为包含体的不溶凝聚物(Shein等，Bio/Technology 7:1141-49,1989)。 一般而言，包含体蛋白是在宿主中过量表达的蛋白，其在表达或纯化的较末期阶段可通过 相差显微镜作为沉淀观察到。包含体是电子致密的无定形颗粒，其与胞质有不连续的分界 但并不被膜包围(Schoemaker等，EMBO J 4:775-780,1985)。在制备包含体时，各种类型 的相互作用可导致其它污染物(例如内毒素、细胞壁碎片和脂类)的二次吸附(Marston FAO, Biochem. J. 240 :1_12，1986)。包含体的平均颗粒大小取决于所表达的特定靶蛋白、宿 主菌株、表达系统以及所用的培养基，其范围可为0. 07 μ m(人生长激素)(BlumP等，Bio/ Technology 10 :301_304，1992)至 1. 5 μ m( β -内酰胺酶)(Bowden 等，Bio/Technology 9 725-730，1991)。包含体的进一步描述可参见美国专利第4，512，922号，其将包含体称为 “折射体”。通常在细胞裂解(例如通过溶菌酶、超声处理或高压勻浆来裂解)后通过数次 离心和洗涤的步骤，从细胞裂解液中采集包含体。参见例如美国专利第4，511，503号；第 4，518，526号；第5，605，691号和第6，936，699号。随后将纯化的包含体用例如去垢剂或 其它溶液(尿素、SDS、盐酸胍)溶解或变性，使不溶蛋白分子解折叠并变得可溶。变性剂 随后可例如通过透析或分子筛来移除，或通过高速离心移除分子量更高的组分并滗出变性 齐U。随后分离出重组蛋白并使其重折叠，以形成有生物活性的正确的高次结构。为了确保最有效的重折叠反应，控制重折叠反应中蛋白的量和浓度是重要的。从 包含体中回收的蛋白通常通过高效液相色谱(HPLC)分析包含体采集物的等分试样来测 定。然而，HPLC法的实时分析是个复杂且费时的过程。因此，本领域仍需要测定重组蛋白制备期间所制备的重组蛋白水平的更加高效且 准确的方法。专利技术概述本专利技术涉及用于测量重组蛋白(细菌)培养物中产生并穿梭至包含体中的蛋白的 改良方法。在一个方面，本专利技术提供了用于计算细菌的包含体(IB)采集物中重组蛋白浓度 的方法，该方法包括在公式中将IB采集浆液等分试样中的干燥固体的总浓度与蛋白生产 率换算系数(PPCF)相乘的步骤，其中该公式的乘积提供了所述IB采集浆液的所述等分试 样中的总重组蛋白的浓度，并且其中所述重组蛋白的PPCF由IB采集浆液的等分试样通过 下述方法测定将该等分试样中重组蛋白与该等分试样中总干燥固体的比乘以1000。总重 组蛋白可依照下式计算x总IB采集浆液的重量，g =(总重组蛋白，mg)。上述蛋白生产率换算系数可依照下式计算(PPCF)=xl000。在备选的实施方案中，换算系数可基于待确定的备选单位来计算。例如，浓度可表 示为g/kg、g/L、mg/g或mg/ml，并且因为物质的密度非常接近于1，故通常这些浓度是等同 的。据此，假设密度接近lg/ml，则用mg/ml表示的浓度相当于用mg/g表示的浓度。在一个方面，重组蛋白可为以转化细菌(即转化或转染了导致编码异源蛋白的基 因表达的重组DNA载体的细菌)中的不溶包含体形式在细菌中表达的任何蛋白。考虑用于 本专利技术的方法的重组蛋白包括但不限于抗体(例如多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人 源化抗体、Fab抗体片段、F(ab' )2抗体片段、Fv抗体片段、Sc Fv抗体片段或SCA抗体片 段、双特异性抗体、双抗体、肽体(P印tibody)、嵌合抗体和线性抗体(linear antibody)), 酶、激素、细胞因子、趋化因子、生长因子、转录因子、跨膜蛋白、细胞表面受体、细胞粘附蛋 白、细胞骨架蛋白、融合蛋白或任何以上蛋白的片段或类似物。在一个实施方案中，将一份包含体采集物等分试样的PPCF用于计算重组蛋白的 浓度，所述蛋白来自按照相同方案获得的不同发酵包含体采集物。在另一个方面，本专利技术考虑首先将上述等分试样的包含体采集浆液中的总重组蛋 白用HPLC试验测定。在一个实施方案中，在使包含物采集等分试样中的包含体溶解后测定 蛋白的效价(titer)，并且通过HPLC分析测定样品中的重组蛋白。在又一个方面，在干燥前不溶解上述包含物采集等分试样内的包含体。本专利技术进一步考虑通过将分离的包含体浆液经由微波辐射干燥来计算包含体等 分试样的干重。在一个实施方案中，所述干燥进一步包括使用加热。在另一个实施方案中， 所述干燥在CEM Lab WaVe9000中进行。进一步考虑可用本领域的常见技术(包括加热、微 波辐射、风干、冷冻干燥(lyophilization，freeze-drying)以及真空干燥)来测定重组蛋 白的干重。一旦将样品干燥，则可使用标准的天平装置测量固体的干重。详述本专利技术涉及用于测定在重组蛋白宿主细胞培养物中产生并穿梭至包含体中的蛋 白的改良方法。正如本文所公开，业已发现在相同或基本相同的发酵条件下，包含体的形成大致 上是一个有序的过程，并且包含体中重组蛋白的组成是非常一致的。通过发现包含体形成 和组成的这种一致性，提出并证实了如下方法通过测量包含体采集浆液的干重或固体百 分比，并接着将该干重的测量结果乘以预设的换算系数来测定包含体中重组蛋白的浓度。 依赖于包含体组成的一致性，该方法测定仅一小等分试样的包含体采集物中重组蛋白的浓 度，以计算蛋白特异性换算系数，并消除了使用费时且复杂的方法(例如HPLC)来测量整个 包含体采集物中蛋白的需要。一旦设计并建立用于在给定的宿主细胞中制备给定重组蛋白 的发酵方法，只要该发酵方法保持基本不变，该蛋白的换算系数可用于推测不同批次的包 含体采集物中的总重组蛋白，而不需要对每个批次进行计算。这一发现提供了在关键步骤 (例如重折叠)前控制蛋白的量/浓度的快速、耐用并且花费更少的方法。此外，预设的换 算系数可用于监测发酵方法的一致性。术语“重组蛋白”是指在转染了异源DNA分子的宿主细胞中表达的异源蛋白分子。术语“包含体”是指细菌宿主细胞内的不溶凝聚物，其含有表达在该宿主细胞中的蛋白。虽然转染的宿主细胞中包含体的蛋白大多是重组(异源)蛋白，但内源(或同源) 宿主细胞蛋白可占总蛋白的一部分。术语“包含体采集物”是指所收集的在用于制备重组蛋白的发酵过程中产生的包 含体。包含体采集物的纯化程度可不同。“杀灭后样品(Post Kill sample) ”是指在细菌裂 解之前而在用本领域已知的技术杀灭细菌之后的细菌培养物样品。细胞糊浆(Cell Paste) 是指在将细菌宿主细胞裂解以释放包含体之前收集(通常通过离心)的包含体采集物的样 品。经洗涤的包含体(WIB)部分是指在将包含体洗涤至少一次或两次(经两次洗涤的包含 体，DffIB)后的包含体采集物。术语“包含体浆液”或“包含体采集浆液”是指包含体采集物，其含有包含体颗粒 的量以及在收集包含体(例如通过离心并滗出上清)后残留的任何本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于计算细菌的包含体采集物中重组蛋白浓度的方法，该方法包括在公式中用蛋白生产率换算系数与ＩＢ采集浆液等分试样中干燥固体的总浓度相乘的步骤，其中该公式的乘积提供了所述ＩＢ采集浆液的所述等分试样的总重组蛋白浓度，其中ＩＢ采集浆液等分试样中所述重组蛋白的ＰＰＣＦ通过将所述等分试样中的重组蛋白与所述等分试样中的总干燥固体的比乘以１０００来计算，其中所述包含体缩写为ＩＢ，所述蛋白生产率换算系数缩写为ＰＰＣＦ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：R张，
申请(专利权)人：安姆根有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]