流式细胞仪制造技术

流式细胞仪，其包括：基于激光二级管的光学子系统，用于将光束入射到通过观察区的粒子上；复合显微镜物镜，用于对由通过观察区的粒子散射的光和发出的荧光进行收集和成像；流体子系统，用于将液体鞘流供应到观察区；蠕动泵，用于将与液体鞘流一起通过观察区的携载粒子的液体试样流注入到液体鞘流内；多模光纤，其接收由复合显微镜物镜收集并成像的从观察区散射和发出的荧光；以及波分多路复用器，用于将经由光纤所接收的光在光学上分离成有色带。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】流式细胞仪
本公开总地涉及流式细胞术的
，并且更具体地，涉及改进的流式细胞仪连同包括在其中的各个独立的组件的结构和操作。
技术介绍
流式细胞术是在细胞计数、分选、生物标志物检测和蛋白质工程中采用的生物物理学技术。在流式细胞术中，悬浮于液流中的细胞通过电子检测设备。流式细胞术允许每秒对高达数千个细胞同时进行物理和/或化学特性的多参数分析。流式细胞术具有包括在分子生物学、病理学、免疫学、植物生物学和海洋生物学领域中的多项应用。流式细胞术在医学中(尤其是在移植、血液学、肿瘤免疫学和化疗、产前诊断、遗传学和用于性别预选的精子分选中)也具有广泛的应用。在海洋生物学中，光合作用浮游生物的自体荧光特性可被流式细胞术用于表征个体密度和群落组成。在蛋白质工程学中，流式细胞术与酵母展示和细菌展示结合使用，以便识别具有所需性质的在细胞表面展示的蛋白质变异体。流式细胞术的一种常见变型是基于粒子的性质对粒子进行的物理分选，从而纯化所关注的群体。整个流式细胞仪系统包括下列主要部件。1.流通池，通常称为鞘流、鞘液体或鞘流体的液流通过流通池，携载细胞或粒子并将细胞或粒子流体动力学地对准，使得细胞或粒子单行通过流通池。2.测量子系统，其耦连到流通池，检测通过流通池的细胞或粒子，且通常是下述之一：a.阻抗或电导率测量子系统；或b.光学照射子系统连同光学感测子系统。3.转换子系统，其用于将来自测量子系统的输出信号转换成计算机可处理的数据。4.计算机，其用于分析由转换子系统所生成的数据。光学照射子系统提供准直而后聚焦的光束，通常为单一波长的激光，其入射到通过流通池的被流体动力学地聚焦的液流上。因此，流式细胞仪系统可具有一个或多个光源，其可以包括：1.一个或多个灯，例如汞灯或氙灯；2.一个或多个高功率水冷式激光器，例如氩、氪或染料激光器；3.一个或多个低功率风冷式激光器，例如氩(488纳米)、HeNe(红-633纳米)、HeNe(绿)和HeCd(UV)；和/或4.一个或多个二极管激光器(蓝、绿、红和紫)。光学感测子系统包括一个或多个检测器，其瞄准聚焦的流液通过所述光速的地方。这种检测器可包括：1.与光束方向一致的检测器(前向散射器或FSC)；2.垂直于光束的检测器(侧向散射器或SSC)；和3.荧光检测器。通过光束的各悬浮粒子对该光进行散射，并且由入射光激发的存在于粒子中或附着于粒子的荧光材料发射比入射光波长更长波长的光。在每个检测器(针对每个荧光发射峰各有一个)处检测和分析散射光和荧光的组合的亮度变化允许推导出有关每个独立粒子的物理和化学结构的各类信息。FSC与细胞容积有关。由于光被散射离开细胞的内部部件，SSC取决于粒子的内部复杂度(即，细胞核的形状、胞质颗粒的数量和类型或细胞膜的粗糙度)。有些流式细胞仪省去荧光检测器而只检测散射光。其它流式细胞仪形成每个细胞的荧光、散射光、以及透射光的图像。流式细胞仪系统的转换子系统通常包括一个或多个模拟-数字转换器(“ADC”)用于将测量子系统的输出信号转换成随后由计算机进行处理的数据，所述转换子系统可包括可为线性或对数的一个或多个放大器。现代流式细胞仪通常包括多达四(4)个激光器和数个荧光检测器。增加激光器和检测器的数量允许以若干不同的抗体来标记细胞，并且可以通过其表型标志物来更精确地识别目标群体。某些仪器甚至可以捕获独立细胞的数字图像，从而允许对细胞内或细胞表面上的荧光信号的位置进行分析。试样照射在大多数的仪器中，诸如血细胞或微球的受关注的粒子由利用流体动力学聚焦的鞘流携载到小杯或喷射流内部的观察区内，并于该处由聚焦的激光束进行照射。该技术提供了准确地识别受关注的粒子并对所述粒子计数的一种手段，而不会被在注册时间窗之外出现的背景噪音所淹没(实用流式细胞术，HowardM.Shapiro，威利(2003)ISBN0471411256)。为了提高检测灵敏度，聚焦激光束的横截面通常是椭圆形的，其中短轴沿着流动方向。为了保持阈值完整性，激光轮廓必须具有沿着流动方向的平滑或钟形轮廓。用于产生这种光束的一种常见方法是，利用由棱镜或柱面透镜对所制成的扩束器沿着流动方向将几乎准直的圆形高斯光束细长化，然后用球面透镜对光束进行聚焦。因为光束在焦点处的形状是光束在远场处的空间傅立叶变换，这产生高斯形椭圆光斑，其中短轴沿着流动方向。传统激光器价格昂贵、体积大且耗电。最近，激光二极管(“LD”)已经可以使用。与传统激光器不同，新一代LD具有成本效益、结构紧凑且节能，并为新一代紧凑型生物医学仪器展现了巨大前景。LD发射具有椭圆形横截面的光，其中经常被称为快轴的椭圆长轴垂直于LD的接头，而经常被称为慢轴的椭圆短轴平行于LD的接头。遗憾的是，典型LD的特别是沿其快轴的光束质量可谓非常不理想，从而使其无法在流式细胞术的应用中被广为接受。原则上，LD光束的质量可通过空间滤波显著改善。如果小型针孔或单模光纤位于透镜的焦点处，使得其只能接受最低阶的空间模式，则通过针孔或单模光纤的光束将是近似完美的高斯形状。序号为5,788,927的美国专利公开这样的光束可在流动通过细胞仪的方向上被准直并扩展，并最终聚焦成椭圆形高斯光束，其中短轴沿着流动方向。遗憾的是，台式仪器的尺寸将针孔的直径限制到小于5微米。可见光波长单模光纤的纤芯大小也具有类似的尺寸。制备精密空间滤波器及其维持它的长期稳定性的挑战不仅增加了基于LD的激光系统的成本，而且还降低了其可靠性。最近，在致力于减少因准直透镜的有限数值孔径的边缘效应所导致的可能的旁波瓣的过程中，序号为6,713,019的美国专利(“'019专利”)公开了将LD旋转过90度(90°)，使得其慢轴平行于流动方向。然后将诸如凹面柱面透镜的光束漫射区段引入，以便在垂直于流动的方向上漫射该准直光束，随后引入诸如球面聚焦透镜的光束光斑形成区段，以便在细胞仪的粒子观察区内形成椭圆形光斑。如在'019专利中详细描述的那样，在光斑形成区段之后的激光束是非常像散性的。具体地，在垂直于流动方向上的在观察区处的光束宽度可与流量通道的宽度相当或大于所述流量通道的宽度。这不仅降低了入射到粒子上的激光能量的量并因此降低信号强度，同时也增加了来自液流细胞界面的非预期的背景散射。取代旋转LD，序号为7,385,682和7,561,267的美国专利公开了使用大数值孔径非球面透镜来用于LD准直。但是这样的设计不能校正LD光束轮廓中固有的边缘效应。因此，目前对适于在流式细胞仪中使用的基于LD的简单光学系统存在需求，其能够可靠地产生沿其短轴具有近高斯形状并且沿其长轴具有一定宽度的聚焦椭圆形光束。观察区显微镜物镜现代的流式细胞仪包括空间滤波器，其通常为机械针孔或大纤芯光纤，位于物镜的图像位置处以防止非预期的背景光进入到细胞仪的检测器内。由于粒子停留在细胞仪的观察区内几微秒，因此必须使用具有大数值孔径的显微镜物镜以最大化集光效率。为了支持在流式细胞仪中的多个空间上分离的激发用激光束，如在序号为4,727,020的美国专利中所公开的那样，也希望使用具有较大视野的物镜。为了实现这些目标，序号为6,510,007和7,110,192的美国专利公开了一种物镜设计，作为最靠近试样的光学元件，其利用了具有凝胶耦连或环氧树脂粘结的接近半球透镜的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种流式细胞仪(40)，包括：a)基于激光二级管(“LD”)的光学子系统(50)，其用于将光束引导到所述流式细胞仪(40)的观察区内，携载粒子的试样液体流动通过所述观察区，所述试样液体通过也流动通过所述观察区的液体鞘流而流体动力学地聚焦在所述观察区内，所述光学子系统(50)包括：i.LD，其用于从其边缘发射发散光束，所述发散光束具有椭圆形横截面轮廓，其具有长轴和短轴；ii.准直透镜，其用于将从所述LD发射的所述发散光束转换成准直的椭圆形光束，其中所述准直的椭圆形光束的所述短轴平行于粒子通过所述观察区的方向而取向；iii.光束压缩光学元件，其用于减少在所述观察区处的所述椭圆形光束的大小，由此垂直于粒子通过所述观察区的方向而取向的所述椭圆形光束的所述长轴的宽度小于所述液体鞘流的宽度；以及v.柱面聚焦元件，其位于邻近所述观察区，其中所述柱面聚焦元件的轴线垂直于粒子通过所述观察区的方向而取向，由此：1)所述光束的所述短轴聚焦在所述观察区处；并且2)在所述观察区处的所述椭圆形光束的所述长轴的尺寸基本上保持不变；b)复合显微镜物镜(60)，其用于对由存在于所述观察区内的粒子散射的光和发出的荧光进行成像，所述复合显微镜物镜(60)包括：i.凹面镜，散射和发出的荧光入射到其上；ii.由光学透明材料制成的像差校正器板，其中所述像差校正器板为非球面透镜，其具有：1)所述像差校正器板的第一区域，其在所述像差校正器板的中性区域之外，所述像差校正器板于该处：A.是最薄的；以及B.具有负的光学倍率；以及2)在所述中性区域内的所述像差校正器板的第二区域，其具有正的光学倍率；从所述复合显微镜物镜(60)反射的光通过所述像差校正器板；所述流式细胞仪(40)的所述观察区位于所述凹面镜和所述像差校正器板之间；c)流体子系统(70)，其用于将所述液体鞘流供应至所述观察区，所述液体鞘流没有脉动，所述流体子系统(70)包括：i.液体泵，其用于供应从储槽抽取的液体；ii.T型联接器，其具有至少一(1)个入口和两(2)个出口，1)所述T型联接器的入口从所述液体泵接收液体；2)由入口所接收的液体的第一小部分经由出口的第一个并且经由旁路导管流回到所述储槽；并且3)由入口所接收的液体的第二小部分经由出口的第二个并且经由粒子过滤器而流到所述流式细胞仪(40)的所述观察区；d)蠕动泵80，其用于供应携载所述粒子的所述试样液体，所述试样液体通过所述液体鞘流流体动力学地聚焦在所述观察区内，所述蠕动泵80包括：i.泵壳体，其具有形成于其中的弧形弯曲轨道，所述轨道在泵入口和泵出口之间延伸；ii.附接到转子的多个辊，所述辊在每对紧邻的辊之间具有大致相等的角间距，所述转子可与附接到其上的辊一起在所述泵壳体内部旋转；以及ii可压缩管，其夹置于所述辊和所述泵壳体的所述弧形弯曲轨道之间，所述弧形弯曲轨道包括：1)出口区段，其中当辊滚动通过所述出口区段时，邻近于所述辊的所述可压缩管从所述出口区段起点处的完全闭合逐渐扩展到在所述泵出口处的完全开放，在所述泵出口处所述辊断开与所述可压缩管的接触；以及2)在所述泵入口和所述泵出口之间沿着所述弧形弯曲轨道的至少一个泵送区段，其中所述可压缩管通过至少一个所述辊被压缩至完全闭合；以及e)波分多路复用器90(“WDM(90)”)，用于将光束分离成多个有色带，所述光束最初从所述观察区发射并由所述复合显微镜物镜(60)成像到用于传输到WDM(90)的光纤内，所述WDM(90)包括：i.准直光学元件，其放大以产生与所述准直光学元件的有效尺寸基本上相同大小的图像；ii.位于所述准直光学元件和所述图像之间的至少一个二色性滤光器，其中所述二色性滤光器将准直光束分离成不同颜色的两(2)个分支；iii.位于所述分支之一内的聚焦光学元件，其中在所述分支内的光束通过所述聚焦光学元件聚焦到具有小于1.0毫米的直径的光斑；以及iv.图像中继光学元件，其位于由在另一个分支内的所述准直光学元件所产生的图像附近，其中所述图像中继光学元件基本上以放大倍率为一来产生所述准直光学元件的图像。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.05.30 US 61/653,328;2012.05.30 US 61/653,245;1.一种具有波分多路复用器WDM的流式细胞仪，所述WDM包括：扩展光源，其提供形成对象的光；准直光学元件，其捕获来自所述扩展光源的光并投射所述对象的放大图像作为第一光束；以及第一聚焦光学元件，其配置为聚焦所述第一光束为尺寸小于入射到第一半导体检测器的所述扩展光源的所述对象。2.根据权利要求1所述的流式细胞仪，其中所述第一聚焦光学元件配置为聚焦所述第一光束为直径尺寸小于1.0毫米。3.根据权利要求1所述的流式细胞仪，进一步包括图像中继光学元件，其布置为接收所述第一光束关注的有色带，所述图像中继光学元件配置为投射第二图像作为第二光束，其中所述第二光束和所述第一光束基本上具有相同的直径。4.根据权利要求3所述的流式细胞仪，其中所述图像中继光学元件是折射光学器件和凹面镜之一。5.根据权利要求3所述的流式细胞仪，其中所述图像中继光学元件是曲率半径大约等于所述准直光学元件和其所投射的放大图像之间的距离的凹面镜。6.根据权利要求3所述的流式细胞仪，进一步包括第二聚焦光学元件，其配置为聚焦所述第二光束为尺寸小于入射到第二半导体检测器的所述扩展光源的所述对象。7.根据权利要求6所述的流式细胞仪，其中所述准直光学元件与所述第一聚焦光学元件之间的光学路径长度和所述图像中继光学元件与所述第二聚焦光学元件之间的光学路径长度基本上相同。8.根据权利要求3所述的流式细胞仪，其中所述图像中继光学元件是凹面形二色性滤光器。9.根据权利要求3所述的流式细胞仪，进一步包括放置在所述准直光学元件与所述第一聚焦光学元件之间的二色性滤光器。10.根据权利要求9所述的流式细胞仪，其中所述准直光学元件与所述第一聚焦光学元件之间的光学路径长度和所述准直光学元件、所述二色性滤光器和所述图像中继光学元件之间的光学路径长度基本上相同。11.根据权利要求9所述的流...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈永勤，
申请(专利权)人：艾瑞斯国际有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US