光声-荧光流式细胞仪制造技术

本发明专利技术公开了一种光声-荧光流式细胞仪。该流式细胞仪包括光学激发系统、荧光信号接收系统、光声信号接收系统、样品台和计算机显示控制系统；光学激发系统分别与荧光信号接收系统、样品台、计算机显示控制系统连接，光声信号接收系统分别与样品台、计算机显示控制系统连接，荧光信号接收系统与计算机显示控制系统连接；计算机显示控制系统分别与光学激发系统、荧光信号接收系统、光声信号接收系统电气连接。本发明专利技术使用脉冲激光作为单一激发光源，同时激发检测物质的光声和荧光信号，通过上下两个通路分别同时采集被检测物质的光声和荧光信号，实现了光声信号和荧光信号的实时检测，可以获取单细胞或颗粒的更多的信息。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于流式检测
，特别涉及ー种光声-荧光流式细胞仪及其检测方法与应用。
技术介绍
流式细胞术是七十年代发展起来的技木，它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，同时具有分析和分选细胞的功能，该技术是ー种在功能水平上对单细胞或颗粒进行定量分析和分选的检测手段。目前，流式细胞检测方法最常用的是荧光流式细胞木，其以连续激光照射高速流动状态下被荧光染料染色的细胞或颗粒，測量其发射荧光的強度，从而达到对细胞或颗粒进行定性或定量的检测和分析的一种细胞分析技木。荧光流式细胞仪目前已在生物医学、分子生物学等领域里被广泛应用。然而，由于依赖外源性荧光染料的荧光检测，其方法存在一定的局限性(I)无法对暗物质(非荧光物质)进行检測；(2)荧光染料在细胞内可能会随细胞的生理状态变化而发生降解、分解或者淬灭等现象，从而无法检测到荧光而漏检。光声效应是指短脉冲光照射某种吸收体时，吸收体吸收光能量而产生瞬间温升，温升引起吸收体的体积胀缩，从而辐射出超声波。光声效应产生依赖于激发光參数和照射对象的光吸收系数，只要有光吸收的物质都能够有效转化为超声信号而被检测，不需依赖于荧光物质。例如红细胞等带内源色素分子的非荧光物质，通过光声激发，检测辐射出来的超声就可实现光声流式检测，而无需再标记外源的荧光色素。因此，将光声流式检测与荧光流式检测的方法结合，利用同一光源同时激发光声和荧光，并同时检测两种能量模式的信号，就可实现光声-荧光双模态的流式检测木，能够有效的弥补荧光流式检测方法的不足，实现双模态，多參数，互补的流式检测新技术。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供ー种光声-荧光流式细胞仪。该流式细胞仪的优点是使用脉冲激光作为单ー激发光源，同时激发检测物质的光声和荧光信号，然后通过上下两个通路，分别同时采集被检测物质的光声和荧光信号，实现两种模态多功能的流式检测。本专利技术的另ー目的在于提供运用上述光声-荧光流式细胞仪的检测方法。本专利技术的再一目的在于提供所述的光声-荧光流式细胞仪的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现ー种光声-荧光流式细胞仪，包括光学激发系统、荧光信号接收系统、光声信号接收系统、样品台和计算机(PC机)显示控制系统；光学激发系统分别与荧光信号接收系统、样品台、计算机显示控制系统连接，光声信号接收系统分别与样品台、计算机显示控制系统连接，荧光信号接收系统与计算机显示控制系统连接；计算机显示控制系统分别与光学激发系统、荧光信号接收系统、光声信号接收系统电气连接；所述的光学激发系统包括激发光源、光阑、柱面透镜、狭缝A、消色差透镜A、反射镜、二色分光镜A和显微物镜；激发光源与计算机显示控制系统电气连接；光阑、柱面透镜、 狭缝A、消色差透镜A、反射镜、二色分光镜A与显微物镜依次机械连接；显微物镜与所述的样品台机械连接；光学激发系统器件全部固定在暗箱中，光阑、柱面透镜、狭缝A、消色差透镜A均可在暗箱轨道中移动，对输出光进行光学整形；所述的暗箱为覆盖整个光路的暗箱；所述的荧光信号接收系统包括依次机械连接的二色分光镜B、滤光片、消色差透镜 B、狭缝B和光电倍增管；二色分光镜B设置于反射镜和二色分光镜A之间，光电倍增管与计算机显示控制系统电气连接；所述的荧光信号接收系统与光学激发系统成共焦结构，即荧光信号接收系统中的狭缝B与样品台分别位于前方对应的消色差透镜B和显微物镜的焦点上；所述的光声信号接收系统包括依次连接的聚焦超声探测器和放大器；聚焦超声探测器和样品台连接，放大器和计算机显示控制系统电气连接；所述的聚焦超声探测器的声学焦点与光学激发系统中的显微物镜的光学焦点共焦；所述的激发光源优选为短脉冲激发光源，激发光源的作用在于激发光声信号和荧光信号；所述的激发光源的激发波长优选为400 2500nm，脉宽范围优选为I 50ns，重复频率优选为IHz 15KHz ；更优选的，所述的激发光源的激发波长为532nm，脉宽范围为10ns，重复频率为 15Hz ；所述的聚焦超声探测器的作用在于接收光声信号；所述的光电倍增管的作用在于接收荧光信号；所述的计算机显示控制系统配置有双通道并行采集卡和采集控制软件，荧光信号和光声信号被双通道并行采集卡采集并存储到带有采集控制软件的计算机；运用上述光声-荧光流式细胞仪检测细胞或颗粒个数的检测方法，包括以下步骤(I)将样品固定放置在样品台中央，将显微物镜放在样品的正上方、聚焦超声探测器置于样品的正下方、光电倍增管置于显微物镜斜上方的荧光出光口处，光电倍增管外面用暗箱封闭；(2)激发光源发出脉冲激光，依次经过光阑、柱面透镜、狭缝A、消色差透镜A、反射镜及显微物镜后，形成一聚焦线光斑横跨于被检测的样品上，并与样品的流动方向垂直；聚焦线光斑的大小优选为5 μ mX60 μ m ;(3)当样品流经线光斑区域时，由于激光的激发而同时产生光声和荧光信号；(4)产生的荧光信号经过显微物 镜、二色分光镜B、滤光片、消色差透镜B、及狭缝B 后被光电倍增管接收；(5)产生的光声信号同时被样品台下方的聚焦超声探测器接收；(6)光声信号和荧光信号分别同时被双通道并行采集卡采集信号强度和时间波形，后储存到计算机中；(7)待采集完成后，通过计算机的信号分析处理，分别得到样品中光声流式检测和荧光流式检测的通过线光斑的细胞或颗粒的计数；步骤(4)中所述的荧光信号的接收方式采用反向共焦接收模式；所述的反向共焦接收模式是指光电倍增管接收的是激发发射光路上的荧光，并且光电倍增管与被检测物成共焦共轭关系，即光电倍増管前的狭缝与样品分别放置在接收与激发光路上的光学焦点上；步骤(5)中所述的光声信号的接收方式采用对向共焦接收模式；所述的对向共焦接收模式是指光学激发系统中的显微物镜与光声信号接收系统中的聚焦超声探測器成对向放置，并且显微物镜的光学焦点与聚焦超声探測器的声学焦点重合；样品通过样品台调整到共焦点上实现共焦点的激发与接收；所述的光声-荧光流式细胞仪可应用于细胞或颗粒的定量分析和监测。本专利技术的工作原理脉冲激光能够被吸收物体吸收光能而产生光声信号或荧光信号，或者同时产生光声和荧光信号。通过单ー的激发光源，同时产生两种信号模式，并实现同时流式检测，利用光声和荧光信号的互补性实现高的检测效率。本专利技术采用激发与接收共焦方式，光声信号和荧光信号分上下两个通道同时被采集。脉冲激光经过光学整形后成聚焦线光斑，而此线光斑分别与聚焦超声探測器和光电倍增管前的线形狭缝处于共焦位置，大大提高了光声信号和荧光信号的检测效率。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果(I)本专利技术将光声和突光流式检测方法结合在一起,在单ー激发光源的激励下同时产生光声和突光信号，可同时获取被检测物的光学及声学參数，实现细胞(或颗粒)的大小、密度、个数等的检测。(2)本专利技术的光声-突光流式细胞仪利用光声和突光信号可以提供互补信息，如暗物质可以利用其光声信号进行分析，弥补现有荧光流式检测依赖于荧光染料标记的问题。(3)本专利技术采用激发与接收共焦方式，消除非共焦信号，仅接受目标处信号，提高了系统检测灵敏度。附图说明图1是实施例1的光声-荧光流式细胞仪的结构示意图，其中1为激发光源，2为光阑，3为柱面透镜,4为狭缝A,5为消色差透镜A, 6为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种光声?荧光流式细胞仪，其特征在于包括光学激发系统、荧光信号接收系统、光声信号接收系统、样品台和计算机显示控制系统；光学激发系统分别与荧光信号接收系统、样品台、计算机显示控制系统连接，光声信号接收系统分别与样品台、计算机显示控制系统连接，荧光信号接收系统与计算机显示控制系统连接；计算机显示控制系统分别与光学激发系统、荧光信号接收系统、光声信号接收系统电气连接；所述的光学激发系统包括激发光源、光阑、柱面透镜、狭缝A、消色差透镜A、反射镜、二色分光镜A和显微物镜；激发光源与计算机显示控制系统电气连接；光阑、柱面透镜、狭缝A、消色差透镜A、反射镜、二色分光镜A与显微物镜依次机械连接；显微物镜与所述的样品台机械连接；所述的荧光信号接收系统包括依次机械连接的二色分光镜B、滤光片、消色差透镜B、狭缝B和光电倍增管；二色分光镜B设置于反射镜和二色分光镜A之间，光电倍增管与计算机显示控制系统电气连接；所述的光声信号接收系统包括依次连接的聚焦超声探测器和放大器；聚焦超声探测器和样品台连接，放大器和计算机显示控制系统电气连接。

【技术特征摘要】
1.一种光声-荧光流式细胞仪，其特征在于包括光学激发系统、荧光信号接收系统、光声信号接收系统、样品台和计算机显示控制系统；光学激发系统分别与荧光信号接收系统、样品台、计算机显示控制系统连接，光声信号接收系统分别与样品台、计算机显示控制系统连接，荧光信号接收系统与计算机显示控制系统连接；计算机显示控制系统分别与光学激发系统、荧光信号接收系统、光声信号接收系统电气连接； 所述的光学激发系统包括激发光源、光阑、柱面透镜、狭缝A、消色差透镜A、反射镜、二色分光镜A和显微物镜；激发光源与计算机显示控制系统电气连接；光阑、柱面透镜、狭缝A、消色差透镜A、反射镜、二色分光镜A与显微物镜依次机械连接；显微物镜与所述的样品台机械连接； 所述的荧光信号接收系统包括依次机械连接的二色分光镜B、滤光片、消色差透镜B、狭缝B和光电倍增管；二色分光镜B设置于反射镜和二色分光镜A之间，光电倍增管与计算机显示控制系统电气连接； 所述的光声信号接收系统包括依次连接的聚焦超声探测器和放大器；聚焦超声探测器和样品台连接，放大器和计算机显示控制系统电气连接。2.根据权利要求1所述的光声-荧光流式细胞仪，其特征在于所述的光学激发系统器件全部固定在暗箱中，光阑、柱面透镜、狭缝A、消色差透镜A可在暗箱轨道中移动；所述的暗箱为覆盖整个光路的暗箱。3.根据权利要求1所述的光声-荧光流式细胞仪，其特征在于所述的荧光信号接收系统与光学激发系统成共焦结构。4.根据权利要求3所述的光声-荧光流式细胞仪，其特征在于所述的荧光信号接收系统中的狭缝B与样品台分别位于消色差透镜B和显微物镜的焦点上。5.根据权利要求1所述的光声-荧光流式细胞仪，其特征在于所述的聚焦超声探测器的声学焦点与光学激发系统中的显微物镜的光学焦点共焦。6.根据权利要求1所述的光声-荧光流式细胞仪，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨思华，李冰冰，邢达，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：