一种利用流式细胞仪检测抗原表达水平的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用流式细胞仪检测抗原表达水平的方法，首先将目的细胞进行免疫荧光染色，然后将染色后的细胞上流式细胞仪检测、进行数据计算和分析。其中在设定所述流式细胞仪的参数时，将待测荧光通道的分辨率降低；获取同型对照或阴性细胞以及目的细胞待测抗原的几何平均荧光强度，再计算出各自的几何平均荧光强度率，以同型对照或阴性细胞的几何平均荧光强度率为界值，若目的细胞待测抗原的几何平均荧光强度率比同型对照或阴性细胞的几何平均荧光强度率高出预定值，则为该待测抗原表达。本发明专利技术有效提高了对目的细胞测定的准确度和精确度，最大限度地减少检测弱抗原表达的实验误差和主观判断误差，将会有效推动流式细胞术在多领域的实用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及流式细胞术
，更具体地讲，涉及一种利用流式细胞仪检测弱抗原表达水平的流式细胞分析方法。
技术介绍
流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段。它以激光为激发光源，可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术，被广泛应用于医学临床以及各个生物研究领域。当前，绝大多数流式细胞仪在理论性能参数上认为能检测到单个细胞上低至100个荧光分子数的弱抗原。但是在实际工作中，不同实验室对这类弱抗原表达的结果判断存在很大偏差。目前在实际操作中，通常会通过常规设置同型对照或阴性对照的方法来判定目的抗原的表达。这对于强阳性和阴性标本容易判断，但抗原表达量低时，结果很难判断。即使在操作中选用荧光强度最强的荧光素如藻红蛋白(PE)标记的单抗也无法改善结果。也有研究者尝试采用间接标记法来改善抗原表达弱的数据分析问题。但间接标记法一方面耗时长，增加了细胞的丢失；另一方面非特异性荧光背景强，因此该方法并不适合临床标本和细胞数少的样本的检测。平均荧光强度是目前检测弱抗原表达水平最常用的统计学指标。但对于小样本事件来说，分析者无法通过抗原表达强度高于同型对照的多少去判断结果有无统计学差异。因此，如果能研发一种简单客观的统计分析方法，最大限度地减少检测弱抗原表达的实验误差和主观判断误差，将会有效推动流式细胞术在多应用领域的实用价值。
技术实现思路
针对上述现有技术中流式细胞仪无法准确检测弱抗原表达的问题，本专利技术提供了。该方法可以增加弱抗原检测的准确性，避免人为的误差。为实现上述的专利技术目的，本专利技术采用如下的技术手段—种利用流式细胞仪检测抗原表达水平的方法，首先将目的细胞进行免疫荧光染色，然后将染色后的细胞上流式细胞仪检测、进行数据计算和分析。在设定所述流式细胞仪的参数时，将待测荧光通道的分辨率降低；获取同型对照或阴性细胞以及目的细胞待测抗原的几何平均荧光强度(Geometric Mean, Geo Mean)，再计算出各自的几何平均荧光强度率，以同型对照或阴性细胞的几何平均荧光强度率为界值，若目的细胞待测抗原的几何平均荧光强度率比同型对照或阴性细胞的几何平均荧光强度率高出预定值，则为该待测抗原表达。具体地，上述方法包括如下的具体步骤(I)将目的细胞进行免疫荧光染色；(2)设置流式细胞仪性能参数，上机检测分析；设置待测荧光通道的分辨率为256 ;通过对同型对照或阴性细胞的检测，在前向散射光(forward scatter, FS) /待测抗原荧光通道双参数图上调节电压，使前向散射光/待测抗原荧光通道的几何平均荧光强度相等，即几何平均荧光强度率为1. O ;获取目的细胞待测抗原几何平均荧光强度，计算几何平均荧光强度率；(3)数据分析若目的细胞待测抗原几何平均荧光强度率高于同型对照或阴性细胞几何平均荧光强度率O. 1，则为待测抗原表达。其中较优地，所述目的细胞为浓度为± IO6细胞/100 μ I的单细胞悬液。其中较优地，所述几何平均荧光强度率计算方法为待测抗原或同型对照或阴性细胞的几何平均荧光强度/目的细胞前向散射光的几何平均荧光强度。其中较优地，所述抗原为单个细胞上至少100个荧光分子数的弱抗原。与现有技术相比较，本专利技术具有以下几个方面的优点1.采用降低荧光通道分辨率的技术思路，有效避免了后期数据分析中由人为因素造成的实验误差，提高了结果判断的真实性和客观性；2.采用几何平均荧光强度分析，对偏态分布和细胞数·极低的抗原表达结果更具统计学意义；3.建立一个新的流式统计学指标几何平均荧光强度率，有效避免了仪器在不同时间段可能存在的电压等仪器参数的轻微偏差，以及不同时间点不同批次样本对结果的影响，提高了对目的细胞测定的准确度和精确度。附图说明图1a为细胞分布呈偏态分布的示意图。图1b为细胞分布呈正态分布的示意图。图2显示了一例慢性淋巴细胞白细胞外周血样本的FS/同型对照gGl-PE (FL2通道)的几何平均荧光强度达到一致(比值为1. O)。图3为一例慢性淋巴细胞白血病外周血样本中肿瘤细胞中ZAP-70-PE与同型对照IgGl-PE的拟合图(黑色分布为同型对照，灰色线为ZAP-70)，分析后几何平均荧光强度率为1. 25，判断肿瘤细胞表达ZAP-70。图4为一例慢性淋巴细胞白血病外周血样本中肿瘤细胞中ZAP-70-PE与同型对照IgGl-PE的拟合图，分析后几何平均荧光强度率为O. 86，判断肿瘤细胞不表达ZAP-70。图5显示了按现有技术对一例慢性淋巴细胞白血病ZAP-70的检测结果。图6显示了 246例慢性淋巴细胞白血病细胞的ZAP-70几何平均荧光强度率增益范围与IgVH发生突变的符合率。图7a显不了一例急性白血病骨髓样本中白血病细胞中⑶137L按原方法表达为18%，判断为阳性。图7b显示了采用本专利技术所述方法分析后几何平均荧光强度率为1. 42，判断肿瘤细胞不表达⑶137L。具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐述本专利技术。下述实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Samtoook等人在《分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1:检测慢性淋巴细胞白血病肿瘤细胞ZAP-70表达水平1.单个核细胞的制备新鲜送检的慢性淋巴细胞白血病外周血标本2ml，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，调单细胞悬液浓度为±IO6细胞/100μ I。上述目的细胞可以根据实际情况中样本的不同而选择不同现有技术进行制备，样本可以是骨髓、外周血或淋巴结等。2.细胞的免疫荧光染色。2.1每管加制备好的单细胞悬液100μ 1，共两管。两管均加入⑶3 +⑶5-FITC/CD19-PerCP鼠抗人单抗(来自BD Pharmingen公司，美国)各20 μ 1，旋涡混匀后，室温避光反应30分钟。 2. 2 PBS洗I次，1000转/每分，离心去上清。2. 3 FIX液固定细胞30分钟后离心去上清。2. 4 Perm液对细胞打孔5分钟后，待测管加ZAP_70_PE鼠抗人单抗，对照管加IgG2a-PE同型对照(均来自BD Pharmingen公司，美国)各20ul，室温避光孵育15分钟，PBS洗细胞一次后去上清。3.加入500uLPBS，上机检测分析。3.1设置荧光通道的分辨率为256。3.2上同型对照管，设门取⑶5 +⑶19+双阳性肿瘤细胞群，在FS/FL2双参数图上调节电压，使FS/FL2的几何平均荧光强度相等，即几何平均荧光强度率为I (参见图2)。3. 3上待测管，收获细胞，分析待测管中肿瘤细胞FS和ZAP-70的几何平均荧光强度。4.计算几何平均荧光强度率，肿瘤细胞ZAP-70几何平均荧光强度率高于同型对照O. 1，为阳性(参见图3)，反之为阴性(参见图4)。在现有技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用流式细胞仪检测抗原表达水平的方法，首先将目的细胞进行免疫荧光染色，然后将染色后的细胞上流式细胞仪检测、进行数据计算和分析，其特征在于：在设定所述流式细胞仪的参数时，将待测荧光通道的分辨率降低；获取同型对照或阴性细胞以及目的细胞待测抗原的几何平均荧光强度，再计算出各自的几何平均荧光强度率，以同型对照或阴性细胞的几何平均荧光强度率为界值，若目的细胞待测抗原的几何平均荧光强度率比同型对照或阴性细胞的几何平均荧光强度率高出预定值，则为该待测抗原表达。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴雨洁，陈昕，李建勇，仇红霞，
申请(专利权)人：南京医科大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：