本发明专利技术公开了一种检测活性细菌含量的方法，特别涉及一种通过联合使用CTC染料染色和流式细胞仪来检测活性细菌含量的方法（简称CTC-流式细胞仪法或CTC-FCM法）。本发明专利技术提供的第一种检测活性细菌含量的方法，是将CTC染料与待测液体样本共孵育，然后通过流式细胞仪检测所述待测液体样本中的活性细菌含量。本发明专利技术中采用灵敏的检测仪器（流式细胞仪）检测微弱标记的细胞以及确定最佳实验条件，可以大大提高所测定的活性细菌的准确度，以达到准确、快速检测活性病原菌的目的。本发明专利技术所采用的方法快速、简便，具有广谱识别性，能够准确、快速检测到活性病原菌，可以用于环境样品中活性病原菌的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，特别涉及一种通过联合使用CTC染料染色和流式细胞仪来检测活性细菌含量的方法。
技术介绍
细菌总数是指ImL水样中的好氧菌、兼性厌氧菌和异养菌在营养琼脂培养基中，于37°C培养24h后，所生长细菌菌落的总数(《水和废水监测分析方法》(第三版))。细菌总数作为我国《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)规定的水质常规指标之一，在评价水质方面具有很大的参考价值。 营养琼脂平板培养法具有一定的局限性，自然环境中只有一小部分的细菌可以在平板上被计数，有研究表面，海水中可被培养法检测到的细菌只占细菌总数的O. 8%。此外，很多厌氧菌和兼性菌无法利用平板培养法检测。不同细菌对温度、培养时间、培养基等培养条件十分敏感，营养琼脂平板培养法难以对各种菌同时进行有效的检测。并且，营养琼脂平板培养法通常需要的检测时间较长(需24h)。同时，大量研究表明，很多细菌在外界环境压力(如高温)下，可进入“具有活性但无法培养” (Viablebut not culturable, VBNC)的状态，致使某些病原菌无法在平板培养基上形成菌落，但仍然保持一定代谢能力和致病性，VBNC状态病原菌能够在适宜条件下恢复其感染性。此外，在平板中的细菌不会全部以相同的速度生成菌落，形成的菌落大小也不同，如果生成了一些微小的菌落，在计数过程中可能被漏掉。因此，平板培养法不能够准确反映水中活性细菌总量。CTC染料(一种氧化还原性染料，英文名称为5-cyano_2, 3-ditolyltetrazoliumchloride,中文名称为5-氰基-2，3- 二甲苯基氯化四氮唑,结构式见式(I )。Cl式 U)。ΧχCTC染料是一种无色的可渗透细胞膜的物质，可以被细菌细胞通过电子传递链还原，在细胞内形成红色荧光沉淀物质CTF (CTC-Formazan,在450/630nm下被激发)，生成CTF的含量与CTC浓度、孵育时间有关。可以还原CTC并产生荧光的细胞即具有呼吸活性的细胞(CTC+)。同时，CTC染料相比与其它氧化还原染料还具有一个独特的优势，即其可以与好氧菌、厌氧菌以及兼性细菌反应。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，特别涉及一种通过联合使用CTC染料染色和流式细胞仪来检测活性细菌含量的方法(简称CTC-流式细胞仪法或CTC-FCM 法)。本专利技术提供的第，是将CTC染料与待测液体样本共孵育，然后通过流式细胞仪检测所述待测液体样本中的活性细菌含量。所述“通过流式细胞仪检测所述待测液体样本(如水样)中的活性细菌含量”的实现方法如下采用流式细胞仪，在450/630nm的激发光下计数可发出红色荧光的物质，每个可发出红色荧光的物质代表一个活性细菌。所述方法中，所述共孵育的初始体系具体可由CTC水溶液、待测液体样本(或待测液体样本的稀释液)和NaCl水溶液组成。所述方法中，所述共孵育的初始体系具体可由20 μ L CTC水溶液、10 μ L待测液体样本(或待测液体样本的稀释液)和70 μ L0. 85g/100mLNaCl水溶液组成。所述方法中，所述共孵育的初始体系中，所述CTC染料的浓度具体可为 2mmol/L。所述共孵育的时间具体可为3小时。所述细菌具体可为大肠杆菌。上述方法中，流式细胞仪参数设置可为FL1:4. 11;FL2:6. 29;FL3:5. 47 ;每次测量的体积为可50 μ L。本专利技术提供的另，是将CTC染料与待测固体样本在液相体系中共孵育，然后通过流式细胞仪检测所述待测固体样本中的活性细菌含量。所述“通过流式细胞仪检测所述待测固体样本中的活性细菌含量”的实现方法如下采用流式细胞仪，在450/630nm的激发光下计数可发出红色荧光的物质，每个可发出红色荧光的物质代表一个活性细菌。所述方法中，所述共孵育的初始体系具体可由CTC水溶液、待测固体样本的悬浮液和NaCl水溶液组成。所述方法中，所述共孵育的初始体系具体可由20 μ L CTC水溶液、10 μ L待测固体样本的悬浮液和70 μ L O. 85g/100mL NaCl水溶液组成。所述方法中，所述共孵育的初始体系中，所述CTC染料的浓度具体可为2mmol/L。所述共孵育的时间具体可为3小时。所述细菌具体可为大肠杆菌。上述方法中，流式细胞仪参数设置可为FL1:4. 11;FL2:6. 29;FL3:5. 47 ;每次测量的体积为可50 μ L。根据不同的研究目的，CTC染料可以与其它技术相结合，如将CTC染料染色与扫描隧道电子显微镜结合，将CTC染料染色与共聚焦激光电子显微镜结合等。如果采用CTC染料染色与共聚焦激光电子显微镜结合来检测活细胞，会存在如下局限性由于细胞自身的代谢特点，使得一些细胞只能在细胞内积累少量的CTF，达不到荧光显微镜检测的最小量，而使得检测结果低于样品中实际活性细菌数；CTC染料染色方法的不同(主要包括CTC染料的终浓度与样品混合后的孵育时间)，对实验结果也会有较大的影响。本专利技术提供的方法的检测原理如下以细胞的呼吸代谢活性作为活性细菌的评判标准；CTC染料可渗透细菌细胞膜，与具有呼吸代谢活性的细菌内的电子传递链反应，在细胞内形成红色荧光沉淀，进而可通过流式细胞仪检测；流式细胞仪可记录样品中单个颗粒的侧向散射光(side light scatter, SS)、绿突光(green fluorescence, FLl, 53015nm)、澄突光(orange fluorescence, FL2, 58521nm)和红突光(redfluorescence, FL3, >650nm);本专利技术中，采用FL3为检测器时，活性细菌和CTC染料反应产生的红色荧光物质被激发，从而实现细菌计数。本专利技术提供的方法的检测原理和流程如图I所示。本专利技术中采用灵敏的检测仪器(流式细胞仪)检测微弱标记的细胞以及确定最佳实验条件，可以大大提高所测定的活性细菌的准确度，以达到准确、快速检测活性病原菌的目的。本专利技术所采用的方法快速、简便，具有广谱识别性，能够准确、快速检测到活性病原菌，可以用于环境样品中活性病原菌的检测。附图说明图I为CTC-流式细胞仪法检测活性菌流程图。图2为不同CTC染料浓度及孵育时间下的结果。图3为大肠杆菌的平板培养法与CTC-流式细胞仪法计数结果比较。 图4为实际水样的平板培养法与CTC-流式细胞仪法分析结果比较。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的PBS缓冲液均为pH 7.2,0. IM的PBS缓冲液。实施例中所用的大肠杆菌，又称大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli):中国普通微生物菌种保存管理中心(网址为 http://www. cgmcc. net/),CGMCC 编号为 1.2385。CTC 染料购自 Molecular Probes,货号为 B34956。实施例I、CTC-FCM方法的最佳浓度及孵育时间的优化I、将大肠杆菌菌液接种于营养肉汤培养基，37°C、160rpm振荡培养16h。2、取100 μ L本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测活性细菌含量的方法，是将CTC染料与待测液体样本共孵育，然后通过流式细胞仪检测所述待测液体样本中的活性细菌含量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何苗，李丹，林怡雯，杨天，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：
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