多能干细胞的传代方法及其用途技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及多能干细胞的传代方法及其用途。该方法包括：将定量的多能干细胞小球移入培养基中，并混合均匀；利用移液器吸取混于培养基的所述多能干细胞小球，并利用所述移液器产生的压力挤压，使其通过30-70μm细胞筛的筛网，形成混于培养基的更多的多能干细胞小团块；将所述混于培养基的多能干细胞小团块移入新的培养皿中，完成传代。该方法用于脊椎动物门的胚胎干细胞和诱导多能性干细胞的传代。本发明专利技术适于悬浮培养形成的多能干细胞小球，是一种无需酶消化的新型传代方法。利用该方法传代后多能干细胞克隆球存活率高，可以达到90％，每次传代比率可达1:8至1:10，可以满足干细胞大规模量产化的需求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及多能干细胞的传代方法及其用途。
技术介绍
多能干细胞(Pluripotent Stem Cells,PSCs)可以在体外适宜的条件下快速增殖而不分化，并且在经过体外大量扩增后，再给予特定条件处理，例如使用蛋白质或小分子化合物的组合诱导，可以使其定向的分化成具有特定功能的细胞，将这些分化后失去多能性的特定细胞收集起来就可用于治疗人类的相关疾病，例如可以将多能干细胞诱导成神经细胞后，注入大脑内用于治疗因神经元缺损导致的老年性痴呆或亨廷顿氏症。工业化生产中，多能干细胞的常见增殖培养方式是贴壁培养和悬浮培养。其中，相比贴壁培养，悬浮培养方式有很多优点，适用于工业化大规模的生产模式，是未来干细胞生物研究和应用发展的趋势所亟需的技术:悬浮培养的多能干细胞的分布呈球形，易于操作处理和回收细胞；悬浮培养可以充分利用空间及培养基，便于集中控制并降低成本，提高效率；悬浮系统产出的多能干细胞更利于向特定功能细胞如神经前体细胞和中胚层心肌前体细胞分化。细胞培养过程中，当多能干细胞增殖达到一定密度后，需要进行传代，进行再培养。现有的传代方法主要有机械传代、酶消化传代，以及酶消化加机械传代三种方式。现有的机械传代是利用极细的玻璃丝将大的集落划切成数枚小片传代，可用于贴壁培养，而悬浮培养的多能干细胞呈实体球状，其毫无附着，无法固定，很难用玻璃丝将其划开，因而不适宜用现有机械 传代。酶消化传代是向细胞中加入胰酶等酶进行消化处理，使细胞分散后传代；可用于贴壁培养，而酶消化对悬浮培养的细胞球表面的细胞起作用快，而球内部细胞消化慢，造成消化不均一，影响了传代细胞的性能，例如团块大于150微米的多能干细胞小块在接种到小鼠饲养层细胞上后易于自发分化，而小于40微米的多能干细胞小块则易于死亡。因而悬浮培养不适宜用酶消化传代。酶消化配合移液枪吹打相较单独酶消化，虽然消化相对均匀，但传代时仍不易掌握和控制，导致制备的小团块大小不均一，无法抑制自发分化，并且降低定向分化的可行性。并且长期采用酶消化，容易引起多能干细胞发生染色体变异或缺失。可见，现有的细胞传代方法不适于悬浮培养多能干细胞的传代。
技术实现思路
本专利技术提供了一种多能干细胞的传代方法及其用途，实现了悬浮培养体系中多能干细胞的传代。本专利技术的技术方案是这样实现的:多能干细胞的传代方法，包括下列步骤:步骤A:将多个多能干细胞小球移入培养基中，并混合均匀；步骤B:利用移液器吸取混于培养基的所述多能干细胞小球，并利用所述移液器产生的压力挤压混于培养基的所述多能干细胞小球，使其通过30-70 μ m细胞筛的筛网，形成混于培养基的多能干细胞小团块；步骤C:将所述混于培养基的多能干细胞小团块移入新的培养皿中，继续培养，完成传代；所述多能干细胞小球为悬浮培养形成的多能干细胞的球状聚集体，并且所述多能干细胞小球的直径为240±40μπι。进一步地,所述步骤B包括:利用移液器将混合后的混于培养基的所述多能干细胞小球，分批通过30-70 μ m细胞筛的筛网；并且每批吸取800μ I混于培养基的所述多能干细胞小球，每批在所述筛网的不同位置通过。进一步地,所述步骤A包括:将每70-90个所述多能干细胞小球移入3ml所述培养基中，并混合均匀。进一步地，所述移液器为移液枪，所述移液枪所用的枪头为带滤芯枪头。进一步地,所述步骤A之前进一步包括:向所述培养基中加入10 μ mo I/L Rock抑制剂Y-27632，并将所述培养基在37°C水浴中预热。进一步地，所述步骤A中的混合均匀包括:利用移液管或移液枪反复吸吹。进一步地，所述继续培养包括:将所述培养皿置于37°C，含5%C02的培养箱中。进一步地，所述步骤B之后和所述步骤C之前进一步包括:用磷酸盐缓冲液或培养基润湿所述培养皿的底部的内表面。进一步地，所述细胞筛为尼龙筛网的无菌细胞筛，和/或，所述培养基为无血清成分确定培养基；和/或，所述培养皿为皮氏培养皿。所述的多能干细胞的 传代方法的用途，所述多能干细胞的传代方法用于脊椎动物门的胚胎干细胞和诱导多能性干细胞的传代。与现有技术相比，本专利技术提供的多能干细胞的传代方法是:用移液器吸取悬浮培养的多能干细胞小球，并利用该移液器产生的压力使细胞小球通过细胞筛的筛网，同时利用筛网具有均匀小孔的特点，从而将其切割成均匀的圆柱形小团块，进行传代，其中，无需细胞自身具有附着点，并且为无酶消化的传代，因而避免了细胞染色体变异；可见，该方法适于悬浮培养形成的多能干细胞小球，利用该方法传代后多能干细胞存活率高，可以达到90%，每次传代比率可达1:8至1:10。此外，本专利技术提供的技术方案还可以达到下列技术效果:(I)简单易行:本专利技术通过细胞筛和移液器两个工具，即可完成传代，所用工具操作简单易行。(2)成本低，耗时少:本专利技术的传代方法无需酶消化，因而避免了酶消化中涉及的清洗、处理、终止等繁琐步骤，因而不仅节省了酶试剂所需的成本，而且节省了生产时间，可用于工业化量产多能干细胞。(3)提高细胞活性，防污染:本专利技术分批切割多能干细胞小球，可以保证得到的细胞小团块尺寸更均匀，从而提高细胞活性；并且每批都在细胞筛的不同位置切割，可以防止污染。(4)培养基安排合理:每70-90个多能干细胞小球用3ml培养基，体积适量，既可以保证细胞生长所需的营养，又可以避免培养基的浪费。(5)切割所用的气流均匀和缓:使用带滤芯的枪头，可以产生均匀和缓的气压，从而进一步提高切割的均匀性。(6)增加细胞的存活率:培养基中加入Rock抑制剂Y-27632，可显著促进细胞增殖，提闻细胞的克隆球形成能力。(7)保证培养基顺利铺展:用磷酸盐缓冲液或培养基润湿所述培养皿的底面，增加了培养皿的浸润性，从而保证培养基可以顺利铺展，防止多能干细胞克隆球相互聚集成团，抑制了自发分化，提高干细胞品质。附图说明为了更清楚地说明本专利技术的具体实施方式，下面将对具体实施方式中所需要使用的附图作简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术的实施例一提供的多能干细胞的传代方法流程图；图2为本专利技术的实施例二提供的悬浮培养的多能干细胞小球的形态图；图3为本专利技术的实施例二提供的多能干细胞传代当天和传代第二日的形态图；图4为本专利技术的实施例二提供的人类胚胎干细胞的8次传代后的多能性染色鉴定结果具体实施例方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本专利技术中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本专利技术所保护的范围。实施例一多能干细胞的传代方法，如图1所示，包括下列步骤:步骤101:将多个多能干细胞小球移入培养基中，并混合均匀；步骤102:利用移液器吸取混于培养基的所述多能干细胞小球，并利用移液器产生的压力挤压混于培养基的所述多能干细胞小球，使其通过30-70 μ m细胞筛的筛网，形成混于培养基的多能干细胞小团块；步骤103:将所述混于培养基的多能干细胞小团块移入新的培养皿中，继续培养，完成传代；所述多能干细胞小球为悬浮培养(非贴壁式)形成的多能干细胞球状聚集体，本文档来自技高网...

【技术保护点】
多能干细胞的传代方法，其特征在于，包括下列步骤：步骤A：将多个多能干细胞小球移入培养基中，并混合均匀；步骤B：利用移液器吸取混于培养基的所述多能干细胞小球，并利用所述移液器产生的压力挤压混于培养基的所述多能干细胞小球，使其通过30?70μm细胞筛的筛网，形成混于培养基的多能干细胞小团块；步骤C：将所述混于培养基的多能干细胞小团块移入新的培养皿中，继续培养，完成传代；所述多能干细胞小球为悬浮培养形成的多能干细胞的球状聚集体，并且所述多能干细胞小球的直径为240±40μm。

【技术特征摘要】
1.多能干细胞的传代方法，其特征在于，包括下列步骤: 步骤A:将多个多能干细胞小球移入培养基中，并混合均匀； 步骤B:利用移液器吸取混于培养基的所述多能干细胞小球，并利用所述移液器产生的压力挤压混于培养基的所述多能干细胞小球，使其通过30-70 μ m细胞筛的筛网，形成混于培养基的多能干细胞小团块； 步骤C:将所述混于培养基的多能干细胞小团块移入新的培养皿中，继续培养，完成传代； 所述多能干细胞小球为悬浮培养形成的多能干细胞的球状聚集体，并且所述多能干细胞小球的直径为240 ±40 μ m。2.如权利要求1所述的多能干细胞的传代方法，其特征在于，所述步骤B包括: 利用移液器将混合后的混于培养基的所述多能干细胞小球，分批通过30-70 μ m细胞筛的筛网； 并且每批吸取800μ I混于培养基的所述多能干细胞小球，每批在所述筛网的不同位置通过。3.如权利要求2所述的多能干细胞的传代方法，其特征在于，所述步骤A包括: 将每70-90个所述多能干细胞小球移入3ml所述培养基中，并混合均匀。4.如权利要求1所述的多能干细胞的传代方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋斌，李天晴，季维智，牛昱宇，
申请(专利权)人：云南中科灵长类生物医学重点实验室，
类型：发明
国别省市：