一种间充质干细胞无血清培养基及其应用制造技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种间充质干细胞无血清培养基及其应用。所述的间充质干细胞无血清培养基包括基础培养基和添加成分，其中，所述基础培养基为IMDM培养基；所述添加成分包括TGF‑β3和抗坏血酸，所述TGF‑β3的浓度为1‑5μg/L，所述抗坏血酸和TGF‑β3的用量比为25‑200mg：1‑5μg。本发明专利技术中的培养基具有良好的促细胞贴壁作用，培养所获得的细胞增殖能力强、形态完整、分泌能力强。相比传统血清培养体系和已有的无血清体系，本发明专利技术中无血清培养基的化学成分明确，且无人源或动物源蛋白、无血清，避免了动物源成分和批次的不稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种间充质干细胞无血清培养基及其应用
本专利技术涉及细胞培养
，具体涉及一种间充质干细胞无血清培养基及其应用。
技术介绍
目前国内外获得大量间充质干细胞的扩增方法依然是添加胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)，胎牛血清中虽然包含多种细胞增殖所需的营养成分，被广泛应用于培养间充质干细胞，然而FBS培养的间充质干细胞往往存在细胞老化过快，杂细胞较多、易发生分化等问题，且FBS中含有多种未知动物来源蛋白，甚至可能携带细菌、病毒、传染性蛋白疾病等。随着血清培养的多种不利因素逐渐出现，血清培养方案也越来越受到业内人士排斥。随着间充质干细胞研究的深入，国内外也逐渐开发出相应的无血清培养方案，这些方案含有多种生长因子、结合转运蛋白、维生素、氨基酸、微量元素、激素等，可在一定程度上去除血清的影响。如CN110564680A中提到了人脐带间充质干细胞培养方法，通过浓缩无血清培养的人脐带间充质干细胞上清，获得细胞分泌蛋白，再通过添加维生素、生长因子、重组蛋白等，从而实现人脐带间充质干细胞的无血清培养，这在完全无血清无异源蛋白的人脐带间充质干细胞培养技术出现之前为人脐带间充质干细胞的无血清培养提供了一种可行性方案。而在CN109749992A提到的间充质干细胞无血清培养方法中，则采用了来自PALL的无血清添加剂，这类无血清培养方案含有多种生长因子、结合转运蛋白、维生素、氨基酸、微量元素、激素等，可在一定程度上去除血清的影响。然而这类无血清添加剂的具体成分未知，往往包含动物源蛋白，无法完全排除异源病毒的危险。同样的，CN109161520A涉及的间充质干细胞无血清培养基采用了来源于UltraCULTURE的无血清添加剂，也面临同样的问题。此外，US2010/0015710A1虽然不包含血清和动物源成分，也不需要对培养耗材进行包被，但在实际使用过程中细胞培养难以超过10代，且细胞形态宽扁、立体感弱、增殖能力不强等。CN105420182公开了一种无血清的脐带间充质干细胞培养基，包括DMEM培养基、碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、胰岛素、白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、亚硒酸钠和纤连蛋白等，通过添加较高含量的纤连蛋白实现了较好的贴壁性能，但细胞增殖速率较慢，且多种细胞外基质的添加大大增加了应用成本。国内部分无血清无异源蛋白的间充质干细胞无血清培养基专利涉及到的培养方法甚至无法重复其所宣传的效果。
技术实现思路
为了提供一种无血清，无动物源成分，不需要基质胶包被的间充质干细胞培养基，本专利技术进行了多年的研发和优化，提供了一种间充质干细胞无血清培养基及其应用。具体而言，本专利技术首先提供了一种间充质干细胞无血清培养基(或称人脐带间充质干细胞无血清无动物源蛋白完全培养基)，包括基础培养基和添加成分，其中，所述基础培养基为IMDM培养基；所述添加成分包括TGF-β3(人转化生长因子)和抗坏血酸，所述TGF-β3的浓度为1-5μg/L，所述抗坏血酸和TGF-β3的用量比为25-200mg：1-5μg。优选为50-150mg：1-3μg；更优选为80-120mg：1-3μg。本专利技术意外发现，在以IMDM培养基为基础培养基的情况下，相较于其他的人转化生长因子(如TGF-β1)，在使用TGF-β3并与抗坏血酸按上述方式复配后，可以促进细胞合成并分泌纤维连接蛋白、胶原蛋白等细胞外基质，并促进细胞迁移，使间充质干细胞具备良好的粘附贴壁效果，且对增殖也具有较好的改善作用。而相较于其他的基础培养基(如DMEM高糖，低糖，a-MEM，DMEM/F12，RPMI1640等)，在本专利技术中应用IMDM培养基时，无论细胞生长速度还是细胞均质性都具有更好的效果。本领域人员可按照公知常识设置培养基中的其他组分，其均可以得到与本专利技术上述描述相当的效果。作为优选，所述添加成分包括0.1-1v/v％化学脂质。本专利技术发现，虽然化学脂质的常规指导用量多为0.1v/v％，但是在0.1-1v/v％(优选为0.3-1v/v％)的范围内，化学脂质的含量越高，细胞的生长状态越好。本专利技术中的化学脂质指多种脂质混合物，包括如下组分：花生四烯酸，含量为1.8-2.2mg/L，胆固醇，含量为200-240mg/L，维生素E(生育酚)，含量为60-80mg/L，亚油酸，含量为8-12mg/L，亚麻酸，含量为8-12mg/L，肉豆蔻酸，含量为8-12mg/L，油酸，含量为8-12mg/L，棕榈酸，含量为8-12mg/L，棕榈油酸，含量为8-12mg/L，PluronicF-68，含量为80000-100000mg/L，硬脂酸，含量为8-12mg/L。更优选地，由如下组分组成：花生四烯酸，含量为2mg/L，胆固醇，含量为220mg/L，维生素E(生育酚)，含量为70mg/L，亚油酸，含量为10mg/L，亚麻酸，含量为10mg/L，肉豆蔻酸，含量为10mg/L，油酸，含量为10mg/L，棕榈酸，含量为10mg/L，棕榈油酸，含量为10mg/L，PluronicF-68，含量为90000mg/L，硬脂酸，含量为10mg/L。在实际应用时，可通过市售途径获得符合上述要求的化学脂质，比如Gibco，11905或Sigma，L0288。更优选的，所述添加成分还包括20-35mg/L的复合酯类物质，所述复合酯类物质为重量比为1-5：5-30：2-20的乙醇胺、胆固醇、大豆卵磷脂的混合物。其与上述的化学脂质共同使用时，可很好地提供细胞生长代谢所需脂类，并有利于促进细胞膜的合成。本专利技术进一步发现，降低氢化可的松的浓度，有利于减缓细胞的老化速度，作为优选，所述添加成分还包括0.1-2mg/L的氢化可的松，更优选其含量为0.1-1mg/L。更优选的，所述添加成分还包括胰岛素、孕酮和地塞米松，所述胰岛素、孕酮、地塞米松和氢化可的松的用量比为8-25mg：1-10μg：4-20μg：0.1-2mg。当上述复配方式添加激素时，可促进细胞利用培养基中的糖类、氨基酸等进行物质合成和能量代谢。作为优选，所述添加组分还包括1-5g/L白蛋白，所述白蛋白是由植物作为表达宿主得到的重组人白蛋白，所述植物优选为水稻。在实际应用时，可通过市售途径获得符合上述要求的重组人白蛋白，比如禾元生物，HYC002M01。本专利技术偶然发现，相较于其他表达宿主(如微生物、动物)得到的重组人白蛋白，通过在本专利技术的配方中使用上述白蛋白，可以进一步改善细胞的贴壁性能和增殖效果，同时使细胞生长形态完整且具有良好的均一性。优选地，所述添加组分还包括转铁蛋白，所述转铁蛋白与所述重组人白蛋白的用量比为10-30mg：1-5g时，可结合并将维生素、脂类、氨基酸以及无机盐离子等转运进入细胞内，为细胞代谢及分裂增殖提供必要成分。作为优选，所述添加组分还包括40-60μg/L的复合生长因子，所述生长因子为重量比为5-40：5-50：2-10的b-FGF(人碱性成纤维生长因子)、EGF(人表皮本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间充质干细胞无血清培养基，包括基础培养基和添加成分，其特征在于，/n所述基础培养基为IMDM培养基；/n所述添加成分包括TGF-β3和抗坏血酸，所述TGF-β3的浓度为1-5μg/L，所述抗坏血酸和TGF-β3的用量比为25-200mg：1-5μg。/n

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞无血清培养基，包括基础培养基和添加成分，其特征在于，
所述基础培养基为IMDM培养基；
所述添加成分包括TGF-β3和抗坏血酸，所述TGF-β3的浓度为1-5μg/L，所述抗坏血酸和TGF-β3的用量比为25-200mg：1-5μg。


2.根据权利要求1所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述添加成分包括0.1-1v/v％化学脂质；
所述化学脂质包括如下组分：
花生四烯酸，含量为1.8-2.2mg/L，胆固醇，含量为200-240mg/L，维生素E(生育酚)，含量为60-80mg/L，亚油酸，含量为8-12mg/L，亚麻酸，含量为8-12mg/L，肉豆蔻酸，含量为8-12mg/L，油酸，含量为8-12mg/L，棕榈酸，含量为8-12mg/L，棕榈油酸，含量为8-12mg/L，PluronicF-68，含量为80000-100000mg/L，硬脂酸，含量为8-12mg/L；
优选的，所述添加成分还包括20-35mg/L的复合酯类物质，所述复合酯类物质为重量比为1-5：5-30：2-20的乙醇胺、胆固醇、大豆卵磷脂的混合物。


3.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述添加成分还包括0.1-2mg/L的氢化可的松；
优选的，所述添加成分还包括胰岛素、孕酮和地塞米松，所述胰岛素、孕酮、地塞米松和氢化可的松的用量比为8-25mg：1-10μg：4-20μg：0.1-2mg。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述添加组分还包括1-5g/L白蛋白，所述白蛋白是由植物作为表达宿主得到的重组人白蛋白，所述植物优选为水稻；
优选地，所述添加组分还包括转铁蛋白，所述转铁蛋白与所述重组人白蛋白的用量比为10-30mg：1-5g。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述添加组分还包括40-60μg/L的复合生长因子，所述复合生长因子包括重量比为5-40：5-50：2-10的b-FGF、EGF和HGF；
优选所述添加组分还包括：2-20μg/L的PDGF-BB；和/或，5-20μg/L的VEGF。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述添加组分还包括IGF-1，所述IGF-1与胰岛素的用量比为10-40μg：8-25mg。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的间充质干细...

【专利技术属性】
技术研发人员：李天晴，冯春，
申请(专利权)人：云南中科灵长类生物医学重点实验室，
类型：发明
国别省市：云南;53