血小板裂解物用于无血清分离和传代培养脐带间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术涉及血小板裂解物用于无血清分离和传代培养脐带间充质干细胞的方法。一方面，本发明专利技术涉及传代培养脐带间充质干细胞的方法，包括如下步骤：接种原代P0代间充质干细胞于培养瓶中，补充传代完全培养基，置CO2培养箱中培养至细胞融合度达70～80％时，弃旧培养基，用D‑hanks液清洗细胞后，加重组胰酶溶液消化细胞使细胞脱落，加D‑hanks液稀释，合并所有细胞悬液至离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞；继续照此从P0代到P1代的传代培养方法获得后续代次例如至P10代的脐带间充质干细胞。还涉及用于脐带间充质干细胞传代培养的传代完全培养基。本发明专利技术方法和所用的培养基呈现如说明书所述优异技术效果。

【技术实现步骤摘要】
血小板裂解物用于无血清分离和传代培养脐带间充质干细胞的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种从脐带中分离和传代脐带间充质干细胞的方法。本专利技术还涉及上述脐带间充质干细胞培养中所用的培养基及相关试液，还涉及无血清培养基在分离和传代脐带间充质干细胞中的用途。使用本专利技术方法分离培养和传代培养所述脐带间充质干细胞时，能够呈现本专利技术所述优异技术效果。特别是，本专利技术涉及使用无血清的培养基从脐带中分离和传代培养间充质干细胞的方法。特别是，在本专利技术分离培养和传代培养所述脐带间充质干细胞中所用的无血清培养基中包含血小板裂解物。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(CaplanAI.Mesenchymalstemcells.JOrthopRes.1991,9:641-650.PittengerMF,MackayAM,BeckSC,etal.Multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells.Science.1999；284:143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。干细胞是人体细胞的祖先，我们体内的所有细胞均来自于干细胞。当体内的细胞衰老死亡或者损伤变性时，干细胞就会生长和转变出可以替代它们的细胞。作为种子细胞，临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。人间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC，在体外扩增培养4～7周，然后再静脉注射入患者体内，患者被分为3组，分别给予不同剂量的MSC，注射后没有观察到毒副作用，提示MSC用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病(GVHD)、心脏系统疾病等，在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。间充质干细胞的分离培养以及传代培养工艺是关系到干细胞作为治疗药物使用安全性的关键步骤。培养工艺中尤其是培养基的成分是主要的影响参数。在已有的文献记载的方法中，对间充质干细胞进行分离培养和传代培养时，所用的培养基多需要添加血清，例如胎牛血清，特别是通常需要添加10％胎牛血清，例如通常采用MSC完全培养基(其为包含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基)对间充质干细胞进行分离和培养传代。然而，一方面，胎牛血清的成本相当高，这对于间充质干细胞的培养是不利的；另一方面，胎牛血清作为一种动物来源的外源性物质，其存在于干细胞中会对细胞的临床使用的安全性产生潜在风险。因此，无血清的分离和传代培养间充质干细胞是有意义的。脐带间充质干细胞(UmbilicalcordMesenchymalStemCells，UCMSCs)是存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人脐带间充质干细胞，培养的细胞具有间充质干细胞的基本特性，为建立间充质干细胞库和临床应用提供了理论依据，然而此法的收率相当有限。脐带间充质干细胞(MSCs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。有报道从人脐带中分离出MSCs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。脐带间充质干细胞的主要用途包括：能具有较强的免疫调节作用，可用于治疗红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病，降低细胞或器官移植后的免疫排斥反应，提高细胞或器官移植的成功率；能促进造血恢复功能，与单一造血干细胞移植比较，间充质干细胞和造血干细胞共移植能显著提高白血病和难治性贫血等疾病的治疗效果；能修复损伤或病变的组织器官，用于治疗骨和肌肉衰退性疾病、心脑血管疾病、肝病、脑及脊髓神经损伤和老年痴呆等。脐带间充质干细胞的一种典型分离培养方法是，取新鲜健康脐带，用PBS冲洗干净后，用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织，将所得组织充分剪碎，加入α-MEM培养液置于37℃，5％的CO2培养箱培养，培养液中含10％FBS，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素。脐带组织培养5-7天后，可见有部分细胞从组织块周围爬出，形态呈细小的梭形，一周后，细胞开始迅速增殖，形成大小不等的细胞集落，待细胞长满后，用0.25％胰蛋白酶消化传代。现有技术公开了诸多有关分离培养脐带间充质干细胞的培养方法。例如，CN102965338A(申请号：2012105103791)公开了一种人脐带间充质干细胞的提取和培养方法。脐带组织切碎后经I型胶原酶消化后移入含培养基的培养瓶中持续培养。所用培养基为低糖DMEM基础培养基并且添加了胎牛血清、成纤维生长因子、上皮细胞生长因子、细胞转录因子、胆固醇。使用该专利技术的提取和培养方法可以长期培养人的脐带间充质干细胞，并且维持干细胞活性。据信该专利技术解决了目前人脐带间充质干细胞培养中细胞衰老过快以及分化问题，能够长期获得具有干细胞特性的人脐带间充质干细胞。CN103421739A(申请号：2013101962521)提供了一种简单、高效分离脐带间充质干细胞的方法，包括：使用插管分离脐带间充质干细胞以及使用trypLETM消化和无血清培养基培养脐带间充质干细胞的步骤。据信该专利技术能够更快的得到完全来自母体的脐带间充质干细胞，而且对细胞的损伤更小；经试验证明专利技术的方法能最大可能的保护间充质干细胞，具有更高活率，以及有更高的活性，可以更加有效进行成脂、成骨诱导分化。CN104232573A(申请号：2014104597914)公开了一种用于培养干细胞的生长培养基，该生长培养基含有基础培养基和添加剂，所述添加剂含有抗人血管内皮生长因子的抗体、抗人类表皮生长因子受体1的抗体、抗人类表皮生长因子受体2的抗体和鸟苷-5-三磷酸三钠盐。该专利技术还提供了所述的生长培养基在培养脐带间充质干细胞中的用途。专利技术还提供了一种培养脐带间充质干细胞的方法，该方法包括：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.传代培养脐带间充质干细胞的方法，包括如下步骤：/n(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；/n(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。/n

【技术特征摘要】
1.传代培养脐带间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；
(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。


2.根据权利要求1的方法，其中
所述D-Hanks液的配方组成如下：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.08g的Na2HPO4.12H2O、0.35g的NaHCO3、水至1000ml；例如，其配制方法如下：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得；
所述传代完全培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：2％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、10ng/ml的EGF、15ng/ml的bFGF、0.035％硫代甘油、1％果糖；和/或
所述DMEM-F12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、L-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、L-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、L-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、L-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、L-苏氨酸53.45mg、维生素H0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、L-丙氨酸4.45mg、D-泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、L-天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、L-天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、L-半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i-肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、L-谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、L-精氨酸盐酸盐147.5mg、L-脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、L-胱氨酸盐酸盐31.29mg、L-色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、L-谷氨酰胺365mg、L-酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、L-缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、L-组氨酸盐酸盐31.48mg、D-葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、L-异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素B12为0.68mg、水适量加至1000mL；配制：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。


3.分离和传代培养脐带间充质干细胞的方法，其包括(a)分离培养原代脐带间充质干细胞和(b)传代培养脐带间充质干细胞两个阶段，其中
(a)分离培养原代脐带间充质干细胞的阶段包括如下步骤：
(a1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的脐带样本；
(a2)D-Hanks充分清洗以去除表面血污，使用手术剪将脐带剪成小段，置于平皿中，用手术镊反复挤压，清除组织中的残留血块，用D-Hanks清洗；
(a3)剪开组织，剥除表皮，剔除动脉和静脉，得到华通氏胶组织，将华通氏胶切割成小块，称重；
(a4)按照规定组织量接种至培养瓶，再添加原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置CO2培养箱中培养；
(a5)培养至第3d补充完全培养基继续培养，至第5d补充原代完全培养基继续培养，至第7d全换液，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脐带间充质干细胞(即P0代)；
(b)传代培养脐带间充质干细胞的阶段包括如下步骤：
(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；
(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。


4.根据权利要求3的方法，其中：
步骤(a3)中，将华通氏胶切割成0.25cm2大小的小块；
步骤(a4)中，按照规定组织量接种至培养瓶是指称取步骤(3)所得华通氏胶组织块1.5g接种至T225培养瓶；
步骤(a4)中，每瓶添加15ml原代完全培养基，充分混匀，使组织块均匀地平铺瓶底，置CO2培养箱中培养；
步骤(a4)中，CO2培养箱中培养的条件为：5％CO2，37℃，饱和湿度；
步骤(a5)中，培养至第3d补充10ml原代完全培养基继续培养；
步骤(a5)中，培养至第5d补充10ml原代完全培养基继续培养；...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖海蓉，李新峰，王正，刘冰，汤乐，
申请(专利权)人：深圳博雅感知药业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44