制备CAR-T细胞的方法技术

本发明专利技术涉及制备CAR

【技术实现步骤摘要】
制备CAR
‑
T细胞的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种分泌IL
‑
7和CCL
‑
17因子，以及分泌中和PD
‑
1和GM
‑
CSF的anti
‑
PD
‑
1与anti
‑
GM
‑
CSFscFv的CD19
‑
CAR
‑
T细胞，本专利技术还涉及此CAR
‑
T细胞例如CD19
‑
CAR
‑
T细胞的制备方法及其用途。

技术介绍

[0002]美国食品药品监督管理局(FDA)2017年8月批准了第一个基因治疗产品Kymriah，此产品能够很好的治疗一些患有急性淋巴细胞白血病(ALL)的儿童和年轻人患者。Kymriah是一种基因改良的自体T细胞免疫疗法，即嵌合抗原受体T(CAR
‑
T)免疫疗法。CAR
‑
T免疫疗法是一种以嵌合型抗原受体为基础的细胞免疫治疗方案，通过体外基因转导技术，将编码嵌合抗原受体CAR
‑
T 基因序列导入T细胞中，生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性T细胞。最常见的CARs包括了一段抗原识别区，比如单克隆抗体(mAb)的单链可变区段(scFv)，和激活T细胞胞内信号域的TCRζ链。
[0003]靶向CD19的CAR
‑
T细胞已经在临床前和临床中表现出惊人的效果，现有研究表明IL
‑
7能延长免疫细胞的存活能力，也能刺激成熟T细胞增殖等，所以IL
‑
7因子可以增强免疫细胞在体内存活时间及抗肿瘤效果；CCL
‑
17也被称作胸腺和活化调节趋化因子，能够提高内源性免疫细胞向肿瘤细胞的聚集能力，进一步增强免疫细胞的抗肿瘤效果。但该疗法却受到其相关毒副作用的限制，如细胞因子释放综合症和神经毒性等。细胞因子综合症主要指免疫细胞与肿瘤细胞作用的过程中，大量释放细胞因子以至于引起进一步的连锁反映，如过度炎症引起的高热寒战、呼吸困难、凝血障碍等，神经毒性引起的头疼、意识模糊、认知改变、语言障碍等症状，最终危及生命。近期，有研究表明单核细胞和巨噬细胞促进CAR
‑
T细胞治疗后的CRS和神经毒性进展，中和巨细胞集落刺激因子(GM
‑
CSF)能够减缓CAR
‑
T细胞治疗后的CRS及神经毒性，且不会抑制CAR
‑
T的功能(Sterner RM, Sakemura R, Cox MJ. GM
‑
CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR
‑
T cell function in xenografts. Blood. 2019 Feb 14；133(7):697
‑
709. doi: 10.1182/blood
‑
2018
‑
10
‑
881722. Epub 2018 Nov 21.)。利用RNA干扰技术高效率敲低CAR
‑
T细胞内GM
‑
CSF表达或分泌表达中和GM
‑
CSF的anti
‑
GM
‑
CSF scFv，预防或减缓细胞因子释放综合症和神经毒性的发生发展，提高CAR
‑
T疗法的安全性。
[0004]在CAR
‑
T细胞治疗肿瘤方面还有肿瘤微环境和免疫应答方面具有十分重要的作用，为了消除肿瘤细胞，需要激活自身免疫系统，免疫细胞的激活与扩增成为消除肿瘤的关键因素，而免疫细胞如T细胞会被肿瘤微环境中免疫检查点分子所抑制，如程序性死亡受体(PD
‑
1)，PD
‑
1在机体中可以下调免疫系统对人体细胞的反映，以及通过抑制T细胞炎症活动来调节免疫系统并促进自身耐受，预防自身免疫性疾病产生，但也可以结合传导抑制性信号，如结合PDL
‑
1配体诱导导致细胞死亡(AICD)产生，限制了体内免疫细胞或CAR
‑
T细胞在体内的持续存在。所以通过PD
‑
1抗体来封闭PD
‑
1免疫检查点，进而修复CAR
‑
T细胞的功能。
[0005]本研究团队公开的CN113583143B提供了一种制备CAR
‑
T细胞的优良方法，然而该
方法仍然存在值得改进的地方。
[0006]因此，本领域仍然期待有改进的肿瘤治疗的方法，例如需要有优良性能的分泌IL
‑
7和CCL
‑
17因子，以及分泌中和PD
‑
1和GM
‑
CSF的anti
‑
PD
‑
1与anti
‑
GM
‑
CSFscFv的CD19
‑
CAR
‑
T细胞。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供了一种制备CAR
‑
T细胞的方法。本专利技术的目的在于改进肿瘤治疗的方法，例如提供一种具有优良性能的分泌IL
‑
7和CCL
‑
17因子，以及分泌中和PD
‑
1和GM
‑
CSF的anti
‑
PD
‑
1与anti
‑
GM
‑
CSFscFv的CD19
‑
CAR
‑
T细胞。
[0008]本专利技术制得的CAR
‑
T细胞亦可称为CD19
‑
CAR
‑
T细胞。
[0009]针对目前CAR
‑
T技术实际需求，本专利技术提供了共表达IL
‑
7和CCL17的CD19 CAR表达质粒的构建，不仅能将IL
‑
7分泌到T细胞外，而且使CCL
‑
17最大程度招募外周血免疫细胞，进一步提高CAR
‑
T的肿瘤细胞杀伤能力。为了增强杀伤效果及降低CRS及神经毒性副作用，同时构建分泌中和PD
‑
1、GM
‑
CSF的anti
‑
PD
‑
1、anti
‑
GM
‑
CSFscFv的质粒。
[0010]为达到此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种嵌合抗原受体，包括：a)作为第一信号的抗原结合结构域、b)跨膜结构域、c)作为第二信号的细胞内传导结构域、以及d)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.制备CAR
‑
T细胞的方法，其包括以下步骤：(1)质粒合成：使用载体pLVX
‑
EF1a
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IRES
‑
PGK
‑
puro合成CAR
‑
19
‑
1质粒，该质粒是由CD19单链可变区、CD8a铰链区、CD8a跨膜区、4
‑
1BB信号、CD3ζ的包浆信号、IL
‑
7、CCL17序列构成，并且具有序列1所述核苷酸序列；(2)病毒包装：使用Invitrogen Lipofectamine 3000转染试剂即Lip3000进行病毒包装，293T培养基为添加10% FBS 的DMEM
‑
H培养基，慢病毒包装培养基为添加1% GlutaMAX、1mM丙酮酸钠、5% FBS的Opti
‑
MEMI培养基；将293T细胞以7x106个细胞/孔的密度接种于含12 mL的慢病毒包装培养基的10cm培养皿中，置于37℃、5% CO2条件下孵育细胞过夜至293T细胞密度达95%；将孵育过夜的培养皿每皿去除6 mL的慢病毒包装培养基，接着向每个皿中加入6mL 的A液
‑
B液混合液，轻混使其分布均匀后置于37℃、5% CO2条件下孵育进行转染；转染6小时后更换293T培养基继续孵育；至转染24小时后，收集12mL细胞上清液，并加入提前预热的12mL的293T培养基，继续于37℃、5% CO2条件下孵育进行转染；至转染54小时后第二次收集细胞上清液，与首次收集上清液混合，得细胞上清液；在室温下，将上一步骤收集的细胞上清液以2000rpm离心10分钟，去除细胞碎片沉淀物，再使用0.45μm滤器过滤上清，得病毒上清液；按照病毒上清液与浓缩试剂以体积比5:1的比例混合，4℃孵育2h，然后于4℃处离心至离心管底有米白色沉淀；小心移去上清，加入适量体积的DMEM重悬沉淀，得到慢病毒浓缩液，测定其病毒滴度；(3)T细胞制备：向含有1mL全血的EP管内添加生物素标记CD8抗体5μL和强化液15μL，室温混合30分钟，所述强化液为包含0.25%吡哆醇和0.12%甘油磷酸钙的无菌水溶液；再向上述1mL全血内添加150μL微泡，室温混合20分钟，将微泡和被抗体标记的细胞结合，离心；用200
µ
L移液枪将白色微泡层轻轻转移至另一个2mL的EP管内，用500μL微泡缓冲液冲洗附着在管壁和移液管头上的微泡，并入EP管内，室温下孵育30min；上述微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/L、磷酸二氢钾200mg/L、氯化钠8000mg/L、七水磷酸氢二钠2160mg/L、1%人血清白蛋白、2mM EDTA；用超声波破泡，离心，收集细胞沉淀，制得T细胞为CD8
+
T细胞，对其进行流式细胞仪鉴定；(4)T细胞激活、转导与扩增：将收集的CD8
+ T细胞以5x105个细胞/mL接种于24孔板/6孔板中，使用激活培养基刺激24
‑
48小时，接着加入MOI=10的慢病毒浓缩液以及转导培养基进行病毒转导，24
‑
48小时后换成维持培养基；扩增至6
‑
8天时，收获CAR
‑
T细胞；其中，激活培养基是包含30ng/mL anti
‑
CD3和20ng/mL CD28的X
‑
VIVOTM15 M...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘庆喜，许晓椿，肖海蓉，魏卿，赵梦莲，
申请(专利权)人：深圳博雅感知药业有限公司，
类型：发明
国别省市：