真核细胞S-腺苷甲硫氨酸浓度感知荧光报告系统技术方案

本发明专利技术属于生化检测领域，涉及一种真核细胞S

【技术实现步骤摘要】
真核细胞S
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腺苷甲硫氨酸浓度感知荧光报告系统


[0001]本专利技术属于生化检测领域，尤其涉及一种真核细胞S
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腺苷甲硫氨酸浓度实时感知荧光报告系统。

技术介绍

[0002]在蛋氨酸循环中，SAM具有重要的作用。甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)催化蛋氨酸与ATP形成SAM，在转甲基反应中，SAM的甲基基团转移到不同的生物受体过程中，转变成S
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腺苷高半胱氨酸(SAH)。SAH在水解酶作用下进一步转变成高半胱氨酸(Hcy)和腺苷。高半胱氨酸有两种命运：被重新甲基化以再生蛋氨酸，或进入转硫途径被转化为半胱氨酸和α
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酮丁酸酯。从生理学方面来看SAM作为甲基供体，参与DNA、RNA和蛋白甲基化。其中的甲基可转移到C，S,N，O原子中，参与到合成与代谢过程中。此外，多种含硫物质的合成均离不开SAM的辅助，在转硫作用的影响下，SAM会产生大量半胱氨酸，经代谢转化为谷胱甘肽，谷胱甘肽是人体的硫储存库。SAM经过脱羧反应后，生产经过脱羧处理后形成多胺，如腐胺，亚精胺，精胺等，促进组织生长。SAM在转甲基作用的影响下，可促进磷脂的甲基化，调节细胞膜的流动，在转硫途径中，生成的GSH是细胞主要的抗氧化剂。SAM脱羧形成的多胺可促进细胞再生，多胺的缺乏会影响细胞的正常分裂与DNA合成。
[0003]SAM是所有细胞中的重要中间代谢产物，特别是在甲基和丙氨基生物转化中起到了核心作用。在大肠杆菌中，MetJ作为抑制因子，它控制参与蛋氨酸生物合成和转运的基因的表达。SAM与MetJ的结合调节了MetJ在细胞中的功能。当蛋氨酸丰富时，SAM积累促进SAM
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MetJ
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蛋白质复合物的形成，两个MetJ二聚体与DNA双链体结合，抑制Met生物合成和转运的基因的表达。研究人员在大肠杆菌体外实验中，验证出不同浓度SAM情况下，MetJ对不同met
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box的结合力不同，此实验结果表明大肠杆菌中的蛋氨酸代谢机制在体外同样可靠(Augustus AM,Sage H,Spicer LD.Binding of MetJ repressor to specific and nonspecific DNA and effect of S
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adenosylmethionine on these interactions.Biochemistry.2010Apr；49(15):3289
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3295.)。虽然甲基化修饰的研究已经取得很多进展，但是人们对甲基化修饰涉及到的基因网络集群的整体认识还不全面,尤其在相关疾病的形成和治疗靶点的选择方面还存在一定的空白有待进一步的研究。
[0004]很多疾病的形成和治疗都与SAM失调相关，如阿尔茨海默病、抑郁症、HIV相关神经功能障碍/痴呆、多发性硬化症、帕金森病、慢性肝功能障碍、动脉硬化和癌症等。研究表明；SAM供给失衡会导致肝脏细胞基因表达改变，引发肝癌。SAM是大脑中多种甲基化反应的甲基供体，包括参与神经递质代谢的甲基反应，而缺乏神经递质和抑郁症有关，而高半胱氨酸的水平升高会引发阿茨海默氏病。此外，SAM与肿瘤密切相关。肿瘤的标志为低甲基化，SAM浓度降低，通过提高SAM浓度可以在一定程度上抑制肿瘤发生。

技术实现思路

[0005]机体内的SAM供给平衡是非常重要的，但是活细胞内进行SAM浓度测定还处于空
白。本专利技术的技术方案通过结合大肠杆菌蛋氨酸代谢调控机制、AAVS1等位基因定点插入、转录组学分析等提供一种实时感知真核细胞SAM浓度的系统，同时也获得了一个可用于全基因组筛选调控SAM代谢的相关基因的系统，将为探究与SAM循环相关的潜在基因以及疾病形成提供基础。
[0006]专利技术人发现了适合检测机体内SAM浓度安全灵敏的方法，该发现对于进一步探究SAM代谢失调相关疾病治疗基因靶点提供研究基础。
[0007]本专利技术所述的候选序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1
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10所示,即表1所示；所述的优选序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:9所示，即表1中的3nat和NS44序列。
[0008]具体的，本专利技术的技术方案如下：
[0009]本专利技术的第一个方面公开了一种实时感知真核细胞SAM浓度的系统,其特征在于，构建方法为：
[0010](1)分别构建AAVS1_Hygro_CMV_3nat_EGFP和AAVS1_Hygro_CMV_NS44_RFP载体，利用CRISPR
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Cas9体系特异剪切人类第19号染色体上的AAVS1位点，将两条供体片段整合到基因组上的安全位点；所述的3nat序列为SEQ ID NO:4，所述的NS44序列为SEQ ID NO:9。
[0011]通过潮霉素B药物筛选实现等位基因定点插入，并通过RCR鉴定和DNA测序获得定点插入的细胞系；
[0012](2)在所述的细胞系中，通过病毒包装系统，过表达KRAB MetJ表达载体，以此构建SAM浓度感知双荧光报告系统。
[0013]进一步地，所述的细胞系为HEK293T。
[0014]进一步地，所述步骤(2)构建病毒包装系统的方法为：通过KRAB MetJ
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PCW57.1质粒与P/G质粒，VSVG质粒，进行三质粒瞬转，培养后后产生慢病毒，利用此病毒感染所述细胞系。
[0015]本专利技术的第二个方面公开了一种SAM浓度检测试剂盒，其特征在于，包括上述实时感知真核细胞SAM浓度的系统。
[0016]本专利技术的第三个方面公开了一种筛选调控SAM代谢的基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0017]根据上述的实时感知真核细胞SAM浓度的系统构建稳定表达Cas9蛋白的细胞系，使用GeCKO慢病毒文库进行全基因组范围的筛选；
[0018]通过病毒感染sgRNA质粒文库后敲除基因，通过流式细胞分选获得不同集群，通过PCR特异地扩增出不同集群的基因序列信息，将来自功能性筛选富集获得的细胞和未经过处理的原文库细胞的PCR扩增序列，通过深度测序分析及比较，可以获得被富集的sgRNA序列信息以及其所对应的基因，依次获得调控SAM代谢的潜在基因。
[0019]本专利技术的第四个方面公开了一种一种KRAB MetJ表达载体。
[0020]本专利技术的第五个方面公开了所述的3nat和NS44序列用于构建实时感知真核细胞SAM浓度的系统的用途。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的创新点在于：
[0022]1)首创性地着眼于大肠杆菌中蛋氨酸代谢这一机制，以及MetJ阻遏蛋白特异性结合met
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box序列偏好性的特点，结合AAVS1定点插入建立出安全可靠的真核细胞SAM浓度感知荧光报告系统，可作为活细胞内SAM浓度监测器。
[0023]2)目前，大规模基因筛选为剖析生物学过程和人类疾病中潜在的基因功能本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种实时感知真核细胞SAM浓度的系统,其特征在于，构建方法为：(1)分别构建AAVS1_Hygro_CMV_3nat_EGFP和AAVS1_Hygro_CMV_NS44_RFP载体，利用CRISPR
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Cas9体系特异剪切人类第19号染色体上的AAVS1位点，将两条供体片段整合到基因组上的安全位点；所述的3nat序列为SEQ ID NO:4，所述的NS44序列为SEQ ID NO:9。通过潮霉素B药物筛选实现等位基因定点插入，并通过RCR鉴定和DNA测序获得定点插入的细胞系；(2)在所述的细胞系中，通过病毒包装系统，过表达KRAB MetJ表达载体，以此构建SAM浓度感知双荧光报告系统。2.根据权利要求1所述的实时感知真核细胞SAM浓度的系统，其中，所述的细胞系为HEK293T。3.根据权利要求1所述的实时感知真核细胞SAM浓度的系统,其中，所述步骤(2)构建病毒包装系统的方法为：通过KRAB MetJ
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PCW57.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：高倩倩，张婷婷，艾宜岑，杨博，徐策，房璐，徐君琴，曾家鑫，吴谦，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：