一种Itch基因敲除细胞株及其应用制造技术

一种Itch基因敲除细胞株及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术提供一种敲除Itch基因的sgRNA序列，在小鼠胚胎成纤维细胞NIH

【技术实现步骤摘要】
一种Itch基因敲除细胞株及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种Itch基因敲除细胞株及其应用。

技术介绍

[0002]Itch，又称atrophin 1相互作用蛋白4(atrophin 1
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interacting protein 4，AIP4)，最初是在研究小鼠表皮颜色时被发现的，因与皮肤瘙痒有关而命名。Itch是一种高度保守的HECT家族E3泛素连接酶，相对分子质量为113000，是含有854个氨基酸残基的单体蛋白，其结构包括：1个N端C2结构域，介导募集的底物蛋白进入细胞膜内；4个ww结构域介导与靶蛋白特异性相互作用，可募集具有丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点或含PPXY结构域的底物蛋白；1个C端HECT结构域可将活化的泛素分子由E2泛素结合酶转移至靶蛋白；1个PRD结构域位于第195
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246个氨基酸残基之间，参与分拣连接蛋白9(sorting nexin 9，SNX9)等底物蛋白的募集。生理情况下，Itch的WW结构域与含PPXY基序的底物特异结合，催化其泛素化并经蛋白酶体降解，参与底物介导的免疫调控、细胞周期等多种生物过程。已有研究显示，Itch的作用靶点是多种信号通路的核心参与调控者，Itch调控了一系列重要因子的泛素化降解过程，如c
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jun、JunB、Notch、p73、p63、CFlip、CHCR4等。编码人类Itch的基因的一个截断突变会导致炎症性疾病，包括肠病。近年来对于Itch的研究有所欠缺，具体的分子机制有待更深一步研究。因此，构建Itch基因敲除细胞株，在体外和体内研究Itch基因的功能，对于研究Itch在相关的多种信号通路中的作用机制具有重要意义。
[0003]实验室目前普遍使用的载体质粒可以将gRNA序列插入到U6启动子，当把该质粒转入细胞之后，质粒将表达特异性gRNA和Cas9，在gRNA的介导下，Cas9对基因进行切割。但是存在的难题是，被剪切的基因在细胞自我修复的过程中存在引入移码造成目的基因缺失的现象，转染后的细胞中存在转染效率低的现象，并且经过细胞自我修复后目的基因可能出现仅突变而没有发生移码的现象。
[0004]此外，基因敲除实验中蛋白质水平的验证也非常关键。蛋白水平的验证通常是通过Western Blot实现的，但以下两种常见现象，有可能导致截短蛋白仍然表达，从而致使WB验证时出现阳性情况。(1)基因产生移码突变后，下游ATG密码子有可能启动翻译，从而导致蛋白表达。或者位于移码突变上游的外显子翻译表达，产生N末端截短蛋白。(2)细胞跳过被编辑的外显子翻译表达，产生内部序列缺失的蛋白质异构体。这些情况将会干扰WB验证结果及后续功能实验，因此，开发一种稳定敲除Itch基因的NIH
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3T3细胞株及其应用具有重要意义。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，为了实现Itch在相关的多种信号通路中的作用机制的进一步研究，本专利技术提供了一种稳定敲除Itch基因的NIH
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3T3细胞株及其应用。本专利技术不仅为研究其分子机制提供了有效工具，还对发现其作为新型的药物靶标和药物发现提供了重要的研究思路。
[0006]专利技术目的
[0007]本专利技术的第一个目的在于提供一种敲除Itch基因的sgRNA序列。
[0008]本专利技术的第二个目的在于提供一种Itch基因敲除细胞株。
[0009]本专利技术的第三个目的在于进一步提供Itch基因敲除细胞株的应用。
[0010]技术方案
[0011]一种细胞株，其特征在于：所述细胞株为Itch基因敲除的细胞株。
[0012]所述的细胞株，其特征在于通过基因编辑技术实现敲除，其中sgRNA序列为
[0013]sgRNA
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A1：ACTGCATGAGCCGCTGCCTGAGG
[0014]sgRNA
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A2：AGTGTTGCCACTGAAGAAACTGG。
[0015]所述的细胞株，其特征在于在小鼠胚胎成纤维细胞NIH
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3T3细胞基因组上敲除Itch基因。
[0016]所述的细胞株在构建肺纤维化模型的应用。
[0017]有益效果
[0018]本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0019](1)本专利技术首次发现通过特异性靶向Itch基因的sgRNA，可构建Itch基因敲除的NIH
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3T3细胞系。经过抗性筛选得到稳定敲除Itch基因的细胞系，经过PCR实验及测序验证敲除Itch基因成功。
[0020](2)本专利技术构建的Itch基因敲除的可传代小鼠胚胎成纤维细胞NIH
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3T3
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Itch
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稳定细胞株，敲除细胞株活性、生长速度等方面均与对照细胞无明显差异，是较为理想的NIH
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3T3敲除的细胞模型。
[0021](3)本专利技术构建的NIH
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3T3
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Itch
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细胞系应用于肺纤维化模型，揭示了Itch在肺纤维化中的作用，不仅为研究其分子机制，还对发现其作为新型的药物靶标和药物发现提供了重要的研究思路。
附图说明
[0022]图1是候选的待敲除外显子信息图。
[0023]图2是待敲除位点所在外显子图。
[0024]图3是PCR鉴定结果图。
[0025]图4是测序结果图。
[0026]图5是Western blot结果图。
[0027]图6是细胞增殖测定结果图。
[0028]图7是α
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SMA(A)和Col
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l(B)测定结果图。
具体实施方式
[0029]下面将结合实施例对本专利技术的实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本专利技术的宗旨和精神的情况下，可以对本专利技术进行各种修改和替换。
[0030]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032]本专利技术在NCBI查找小鼠Itch基因(Gene ID:16396)，找到该基因CDS区，分析小鼠Itch基因组结构，明确CDS的外显子部分。选择外显子的原因在于，基因敲除的难度会随着敲除片段长度的增加而增加，而一般基因包含的外显子区都比较短，但内含子区却很大，敲除整个基因就会变得很困难。而且，在基因的内含子区，往往存在功能基因序列，有可能包含着其他基因的调控元件，如果全部敲除就会影响其他基因的表达，甚至影响了实验结果的可信度。因此，本专利技术根据外显子选择原理，首先找到该基因CDS区，明确CDS的外显子部分，避开靶向被跳跃的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞株，其特征在于：所述细胞株为Itch基因敲除的细胞株。2.根据权利要求1所述的细胞株，其特征在于通过基因编辑技术实现敲除，其中sgRNA序列为sgRNA
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A1：ACTGCATGAGCCGCTGCCTGAGGsgRNA
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A2：A...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈君，朱雪林，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：