一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法技术

本发明专利技术公开一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，包括以下步骤：S1、小鼠肺微血管内皮原代细胞分离：分离新生小鼠边缘肺组织，用眼科剪刀将组织剪成小块，制备单细胞悬液，磁珠阴性选择去除CD45

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，具体是一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法。

技术介绍

[0002]肺微血管内皮细胞(PMECs)是肺泡毛细血管屏障的重要组成部分，参与气体交换。它们在肺内稳态和炎症反应中发挥重要作用。鉴于PMECs的重要作用，体外培养PMECs对于阐明肺部疾病的分子和细胞机制至关重要。小鼠肺微血管内皮细胞(pMPMECs)的研究受到细胞培养的限制。目前已经发表的分离pMPMECs最常见的方法包括：肺组织的酶解和pMPMECs对CD31或CD102磁珠免疫结合法。但是，pMPMECs的阳性磁珠选择会导致细胞早期衰老，增殖能力低。此外，磁珠的非特异性结合通常会导致肺组织中其他细胞(如成纤维细胞、平滑肌细胞、上皮细胞)的污染。
[0003]PMECs分泌的细胞外囊泡(PMEC
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EVs)直接分泌到血流中，并能与循环白细胞相互作用，调节局部免疫反应。越来越多的研究表明，PMEC
‑
EVs与炎症性肺部疾病的病理生理有关，而PMEC
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EVs介导肺部疾病的具体作用机制研究尚处于探索阶段。由于pMPMECs分泌EV的能力有限，且缺乏可靠的pMPMECs细胞系。许多研究者在研究中使用脐静脉内皮细胞来源的囊泡而不是PMEC
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EVs。然而，囊泡具有高度的异质性，不同来源的囊泡特性差异很大。因此，使用其他内皮细胞来源的囊泡来探索PMECs
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EVs在肺部疾病中的作用可能会导致研究偏倚。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，解决了上述技术问题，避免了传统磁珠阳性选择提取细胞的损害，极大改善内皮细胞的损耗和细胞老化问题；通过转染慢病毒至原代细胞，构建永生化细胞，永生化细胞分泌囊泡保留了原代细胞分泌囊泡的特性，极大降低囊泡提取效率和成本。
[0005]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0006]一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，包括以下步骤：
[0007]S1、小鼠肺微血管内皮原代细胞分离
[0008]1)小鼠肺缘单细胞悬液的制备
[0009]分离小鼠肺组织，组织碎化并制备单细胞悬液；
[0010]2)小鼠肺缘单细胞培养
[0011]将单细胞悬液加入完全培养基培养至细胞融合度90％以上；
[0012]3)小鼠肺微血管内皮细胞的分离纯化
[0013]对重悬后的单细胞进行阴性选择：利用抗小鼠CD45磁珠、抗小鼠CD90.2磁珠和抗小鼠CD326磁珠分别去除淋巴细胞、成纤维细胞和上皮细胞；
[0014]S2、内皮细胞永生化
[0015]S2.1将500ul小鼠肺微血管内皮原代细胞悬液种于胶原包被的24孔板中(3
×
104个细胞/孔)，培养24h。
[0016]S2.2将含有GFP的慢病毒(1x 107IU/mL)在37℃水浴中解冻，解冻后立即将其从水浴中移出。然后加上30、60、90、120和150μL慢病毒原液(含5μLViralEntry)，建立不同MOI(MOI＝10,20,30,40,50)。使用mPMECs培养基将体积调整为500μL。
[0017]S2.324孔板4000转/分，离心30分钟，以增加转导效率，然后在培养箱中(37℃，5％CO2)孵育72h。
[0018]S2.4倒置荧光显微镜拍摄不同的MOIs下细胞36、48、60、72h的照片，评估不同MOI、时间下病毒转导率。
[0019]S2.5置于37℃水浴中解冻慢病毒(Lenti
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SV40,Lenti
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SV40T,Lenti
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SV40 T(puro),Lenti
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RasV12,Lenti
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hTERT,Lenti
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HPV
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16E6/E7(puro))，解冻后立即从水浴中移除。然后，在含有5μL ViralEntry的mPMECs培养基中加入适量的慢病毒颗粒。
[0020]S2.6将S2.5中含有ViralEntry和慢病毒的mPMECs培养基在培养箱中共孵育48h后，更换mPMECs培养基。
[0021]S2.7当细胞90
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95％汇合时，消化细胞。将第一次转导的pMPMECs在胶原包被的24孔板上重新播种，每2天更换培养基，重复S2.5
‑
S2.6重复慢病毒转导，并监测细胞生长速率和形态，以选择永生的候选细胞。
[0022]S3、小鼠肺微血管内皮细胞囊泡提取。
[0023]进一步地，所述小鼠肺缘单细胞悬液的制备的具体操作步骤：
[0024]于无菌培养皿取出小鼠双肺，剥离脏层胸膜后剪去两侧肺缘，置于DMEM
‑
F12基础培养基中，漂洗3次后移入5ml规格的离心管中，加入适量I型胶原酶工作液。
[0025]剪碎组织，补齐胶原酶工作液至10ml，将混合液转入C管中，并置于组织研磨仪处理。
[0026]处理后将C管置于恒温水平摇床中震荡30min，再置于组织研磨仪处理，得到混悬液通过70um尼龙滤网过滤后离心，DMEM
‑
F12基础培养基清洗3次后加入红细胞裂解液充分裂解、终止、离心后计算活细胞数量，得到肺缘单细胞悬液。
[0027]进一步地，所述小鼠肺缘单细胞培养步骤为：
[0028]将单细胞悬液加入完全培养基后重悬、调整细胞密度，置于T
‑
75培养瓶中培养24小时后弃去上清，重新补充完全培养基，每隔两天换液、观察，直至细胞融合度至90％以上。
[0029]进一步地，所述小鼠肺微血管内皮细胞的分离纯化步骤包括：
[0030]将肺缘单细胞消化重悬为单细胞悬液后，利用抗小鼠CD45磁珠、抗小鼠CD90.2磁珠和抗小鼠CD326磁珠分别去除淋巴细胞、成纤维细胞和上皮细胞。
[0031]将阴性选择剩余的细胞重新置于培养皿中培养，2天更换一次培养基并通过光镜观察，利用记号笔圈出内皮细胞集落边缘后，再利用克隆环选出内皮细胞集落。
[0032]进一步地，所述步骤1)中选用出生7
‑
14天乳鼠。
[0033]进一步地，所述I型胶原酶工作液为I型胶原酶溶解于含有血清的完全培养基中。
[0034]进一步地，所述红细胞裂解液加入10倍体积完全培养基终止。
[0035]进一步地，所述完全培养基含有92mg/L D
‑
valine，100IU/ml肝素，1％ECGS。
[0036]进一步地，所述S2中助转染试剂选用ViralEntry。
[0037]所述慢病毒包括Lenti
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SV40,Lenti本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、小鼠肺微血管内皮原代细胞分离1)小鼠肺缘单细胞悬液的制备分离小鼠肺组织，组织碎化并制备单细胞悬液；2)小鼠肺缘单细胞培养将单细胞悬液加入完全培养基培养至细胞融合度90％以上；3)小鼠肺微血管内皮细胞的分离纯化对重悬后的单细胞进行阴性选择：利用抗小鼠CD45磁珠、抗小鼠CD90.2磁珠和抗小鼠CD326磁珠分别去除淋巴细胞、成纤维细胞和上皮细胞；S2、内皮细胞永生化小鼠肺微血管按照比例接种入24孔板，加入慢病毒和助转染试剂后培养并进行第二轮转染，所得细胞持续传代培养，直至选出可保持形态的细胞即为永生化成功；S3、小鼠肺微血管内皮细胞囊泡提取。2.根据权利要求1所述的一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，其特征在于，所述小鼠肺缘单细胞悬液的制备的具体操作步骤：于无菌培养皿取出小鼠双肺，剥离脏层胸膜后剪去两侧肺缘，置于DMEM
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F12基础培养基中，漂洗3次后移入5ml规格的离心管中，加入适量I型胶原酶工作液；剪碎组织，补齐胶原酶工作液至10ml，将混合液转入C管中，并置于组织研磨仪处理；处理后将C管置于恒温水平摇床中震荡30min，再置于组织研磨仪处理，得到混悬液通过70um尼龙滤网过滤后离心，DMEM
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F12基础培养基清洗3次后加入红细胞裂解液充分裂解、终止、离心后计算活细胞数量，得到肺缘单细胞悬液。3.根据权利要求2所述的一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，其特征在于，所述小鼠肺缘单细胞培养步骤为：将单细胞悬液加入完全培养基后重悬、调整细胞密度，置于T
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75培养瓶中培养24小时后弃去上清，重新补充完全培养基，每隔两天换液、观察，直至细胞融合度至90％以上。4.根据权利要求3所述的一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法，其特征在于，所述小鼠肺微血...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱海波，刘旭，夏飞萍，郭凤梅，刘玲，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：