一种肿瘤干细胞向神经元方向分化方法技术

本发明专利技术提供了一种肿瘤干细胞向神经元方向分化方法，该方法包括肿瘤干细胞获取，肿瘤干细胞向神经元诱导分化，分化后神经元的培养等；本发明专利技术并对分化后的神经元进行了一定的验证工作，证实了肿瘤干来源的神经元具备神经元的特异性标志物，并通过膜片钳验证了肿瘤干来源的神经元具有钠离子内流信号。源的神经元具有钠离子内流信号。源的神经元具有钠离子内流信号。

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤干细胞向神经元方向分化方法


[0001]本专利技术属于细胞生物学领域，尤其是涉及一种肿瘤干细胞向神经元方向分化方法。

技术介绍

[0002]肿瘤干细胞（CSCs）是一种具有类似于体细胞干细胞能力的癌细胞亚群。CSCs在肿瘤的发生、转移、复发和耐药过程中起着关键作用。绝大部分的肿瘤被认为起源于CSCs，这可能是导致肿瘤临床治疗原发性和获得性耐药的重要原因之一，因此，近年来对于肿瘤干细胞的研究吸引了国内外肿瘤基础科研的广泛关注。目前已知有少数几种人类肿瘤，可自发性地从未分化的恶性肿瘤退变为完全良性肿瘤，而神经母细胞瘤细胞分化为神经元细胞就属于其中之一。
[0003]随着干细胞与再生医学技术的不断发展，干细胞这一具有无限自我更新复制以及分化再生能力的原始细胞群体，在组织的修复与再生方面展现出了巨大的潜力。因此，很多科研人员开始致力于利用干细胞对退行性神经系统进行修复。而经过科研人员数年的探索，截止到目前为止，干细胞干预神经退行性疾病领域，已相继取得突破，为神经退行性疾病患者带来了新的希望。目前修复神经元的干细胞主要起源于神经干细胞，由于神经干细胞来源及获得比较困难，所以制约着神经再生的研究进展。因此，CSCs的定向分化不仅是一种潜在的癌症治疗策略，而且为神经再生修复提供了一种新的思路。
[0004]目前肿瘤干主要从肿瘤组织及肿瘤细胞系中获得，由于从临床来源的肿瘤组织获得有限，且部分肿瘤组织需要进行临床病理分析，用来分离肿瘤干的大部分肿瘤组织以癌旁组织为主，这也制约着肿瘤干细胞的获取。由于以上原因，越来越多的研究者聚焦在从肿瘤细胞系中分离肿瘤干细胞。
[0005]在肿瘤干细胞向神经细胞分化的研究中，大部分研究参照神经干细胞向神经元诱导方法为主，其方法为培养过程中去除血清并加入神经营养因子及ATRA诱导剂为主，此方法促使肿瘤干细胞向神经元分化的能力及效率偏低，且分化后的神经细胞功能有待进一步提高。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术旨在提出一种肿瘤干细胞向神经元方向分化方法，通过新的诱导方法，使肿瘤干细胞能够快速向神经元分化，分化后的神经元具备神经元特异性标志物，并具备钠电流信号。
[0007]为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种肿瘤干细胞向神经元方向分化方法，该方法包括如下步骤：S1、肿瘤干细胞获取；S2、肿瘤干细胞向神经元诱导分化；S21、将肿瘤干细胞接种在分化培养基中培养3
‑
7天，中间每2天换液1次，其中分化
培养基为包含FBS、MEM
‑
100x、青链霉素100x、全反式维甲酸ATRA和姜黄素的DMEM/F12完全培养基；S22、将分化后的细胞导入神经元维持培养基中继续培养7
‑
14天，神经元维持培养基为包含BDNF、NGF、MEM
‑
100x、青链霉素100x和B27的Neurobasal Medium A完全培养基。
[0008]进一步，分化培养基中FBS的体积分数为1%
‑
8%，MEM
‑
100x的体积分数为0.5%
‑
2%，青链霉素100x的体积分数为0.1
‑
0.4%，ATRA的用量为每升1μM
‑
10μM，姜黄素的用量为每升0.5μM
‑
5μM。
[0009]进一步，每100mL分化培养基中FBS的用量为5mL，MEM
‑
100x的用量为1mL，青链霉素100x的用量为200
µ
L，ATRA的用量为1
µ
M，姜黄素的用量为0.5
µ
M。
[0010]进一步，神经元维持培养基中BDNF的浓度为10ng/mL
‑
80ng/mL，NGF的浓度为5ng/mL
‑
40ng/mL，MEM
‑
100x的体积分数为0.5%
‑
2%，青链霉素100x的体积分数为0.1
‑
0.4%，B27
‑
50x的体积分数为0.5%
‑
4%。
[0011]进一步，每100mL神经元维持培养基中BDNF的浓度为50ng/mL，NGF的浓度为10ng/mL，MEM
‑
100x的用量为1mL，青链霉素100x的用量为200
µ
L，B27
‑
50x的用量为2mL。
[0012]进一步，在进行S2步骤之前先将得到的肿瘤干细胞使用胰酶消化得到单细胞。
[0013]进一步，步骤S21的培养条件为：37℃、5% CO2培养箱中培养。
[0014]进一步，步骤S1具体包括如下步骤：1）胶质瘤细胞系U
‑
118MG干性培养；将U
‑
118MG细胞接种在肿瘤干细胞培养基中，培养3
‑
5天，肿瘤干细胞培养基为包含1
‑
40ng/ml的bFGF、1
‑
20ng/ml的EGF、0.5
‑
4%的B27
‑
50x、0.1
‑
0.4%青链霉素100x的无血清DMEM/F12完全培养基；2）免疫磁珠分选；3）分选后差速贴壁纯化；4）肿瘤干快速扩增。
[0015]本专利技术还提供了一种由上述任一项所述的分化方法得到的神经干细胞。
[0016]相对于现有技术，本专利技术所述的肿瘤干细胞向神经元方向分化方法具有以下优势：本专利技术所述的肿瘤干细胞向神经元方向分化方法在向神经元分化过程中全反式维甲酸（ATRA）与姜黄素（curcumin）联用，姜黄素协同ATRA抑制肿瘤干细胞增殖，并通过抑制Notch1信号通路促进肿瘤干细胞向神经元分化，展现了较强的向神经元分化的能力，且分化后的神经元具有成熟神经元的标志物，并具有钠离子信号。
附图说明
[0017]构成本专利技术的一部分的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1为本实施例肿瘤干细胞图；图2为本实施例肿瘤干细胞流式鉴定图；图3为本实施例肿瘤干细胞向肿瘤细胞分化图；图4为本实施例肿瘤干细胞向神经元分化后透射光图；
图5为本实施例肿瘤干细胞向神经元分化后βIII Tubulin荧光图；图6为本实施例肿瘤干细胞向神经元分化后钠电流I
‑
V曲线图；图7为对比例肿瘤干细胞向神经元分化后透射光图。
具体实施方式
[0018]需要说明的是，在不冲突的情况下，本专利技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0019]下面将参考附图并结合实施例来详细说明本专利技术。
实施例
[0020]肿瘤干细胞向神经元方向分化方法包括如下步骤：1）U
‑
118MG细胞复苏：将癌细胞培养液及DMEM/F12基础培养基于水浴本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤干细胞向神经元方向分化方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：S1、肿瘤干细胞获取；S2、肿瘤干细胞向神经元诱导分化；S21、将肿瘤干细胞接种在分化培养基中培养3
‑
7天，中间每2天换液1次，其中分化培养基为包含FBS、MEM
‑
100x、青链霉素100x、全反式维甲酸ATRA和姜黄素的DMEM/F12完全培养基；S22、将分化后的细胞导入神经元维持培养基中继续培养7
‑
14天，神经元维持培养基为包含BDNF、NGF、MEM
‑
100x、青链霉素100x和B27
‑
50x的Neurobasal Medium A完全培养基。2.根据权利要求1所述的肿瘤干细胞向神经元方向分化方法，其特征在于：分化培养基中FBS的体积分数为1%
‑
8%，MEM
‑
100x的体积分数为0.5%
‑
2%，青链霉素100x的体积分数为0.1
‑
0.4%，ATRA的用量为每升1μM
‑
10μM，姜黄素的用量为每升0.5μM
‑
5μM。3.根据权利要求2所述的肿瘤干细胞向神经元方向分化方法，其特征在于：每100mL分化培养基中FBS的用量为5mL，MEM
‑
100x的用量为1mL，青链霉素100x的用量为200
µ
L，ATRA的用量为1
µ
M，姜黄素的用量为0.5
µ
M。4.根据权利要求1所述的肿瘤干细胞向神经元方向分化方法，其特征在于：神经元维持培养基中BDNF的浓度为10ng/mL
‑
80ng/mL，NGF的浓度为5ng/mL
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖海蓉，刘庆喜，魏卿，房帅，
申请(专利权)人：深圳博雅感知药业有限公司，
类型：发明
国别省市：