构建原位原发鼻咽癌动物模型的方法技术

本发明专利技术公开了一种原位原发的鼻咽癌肿瘤模型制备方法，属于肿瘤动物模型领域。本发明专利技术通过将小鼠鼻咽细胞以特定培养基培养成类器官，再将类器官进行基因编辑，注射回小鼠鼻咽部，使其发展成肿瘤。本发明专利技术的方法相比基因工程肿瘤动物模型耗时短，成瘤率高；相比移植瘤动物模型，具有肿瘤发生和发展的体内微环境，更接近鼻咽癌最真实的状态。更接近鼻咽癌最真实的状态。更接近鼻咽癌最真实的状态。

【技术实现步骤摘要】
构建原位原发鼻咽癌动物模型的方法


[0001]本专利技术属于肿瘤动物模型领域。

技术介绍

[0002]鼻咽癌是指发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤。流行病区主要在东亚、东南亚地区，是我国高发恶性肿瘤之一，发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首。
[0003]在研究鼻咽癌发生发展机理，以及开发鼻咽癌治疗药物过程中，离不开鼻咽癌动物模型。
[0004]当前常用于科学研究的鼻咽癌动物模型主要分为三类，包括基因工程动物模型、肿瘤细胞系移植瘤模型以及人源异种移植瘤模型(PDX，patient derived Xenograft model)。
[0005]基因工程动物模型具有良好的肿瘤微环境和良好的可重复性，且免疫系统无缺陷，但其需要制备转基因动物，成本高、制备周期长。肿瘤细胞系移植瘤模型只需将人源肿瘤细胞系植入模型动物，容易制备，可重复性高，但需使用免疫缺陷小鼠，且得到的肿瘤非原位原发性肿瘤，与肿瘤实际发展情况与病理生理情况区别较大。PDX模型是将病人体内肿瘤组织接种于模型动物体内，容易制备，基因型与实际肿瘤接近，但非原位肿瘤，无法提供鼻咽组织原位微环境，进而可能导致人源肿瘤在实验过程中相关生物学特征丢失，无法模拟人体内的情况，而且目前临床肿瘤标本非常珍贵，一些特殊的临床标本如穿刺标本等小标本可供实验研究的组织细胞量较少，鼻咽癌PDX模型构建成功率也比较低，无法满足模型构建需求。
[0006]综上，为探究鼻咽癌发生发展机理和开发新型鼻咽癌治疗药物，迫切需要一种贴近鼻咽癌生物学特征、操作时间短、可重复性高且通量高的鼻咽癌动物模型。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种更接近鼻咽癌生物学特性、制备周期短、且基因型确定的原位原发小鼠鼻咽癌模型。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0009]一种培养人或动物鼻咽组织细胞类器官的培养基，配方如下：
[0010]B2750
±
5倍浓度稀释N-acetylcysteine1
±
0.1mMEGF50
±
5ng/mLNoggin100
±
10ng/mLR-spondin 1250
±
25ng/mLA83-01200
±
20nMFGF10500
±
50ng/mLNicotinamide10
±
1mM
Y-2763210
±
1uMWNT3a25
±
2.5ng/mLGlutamax100
±
10倍浓度稀释N2100
±
10倍浓度稀释Gastrin1
±
0.1nM
[0011]。
[0012]进一步的，所述培养基的配方为：
[0013]B2750倍浓度稀释N-acetylcysteine1mMEGF50ng/mLNoggin100ng/mLR-spondin 1250ng/mLA83-01200nMFGF10500ng/mLNicotinamide10mMY-2763210uMWNT3a25ng/mLGlutamax100倍浓度稀释N2100倍浓度稀释Gastrin1nM
[0014]。
[0015]一种构建原位原发鼻咽癌动物模型的方法，包括如下步骤：
[0016]1)人或动物鼻咽组织细胞原代培养；
[0017]2)将细胞固定在Matrigel内，加培养基培养成类器官；
[0018]3)将类器官重悬成单细胞，进行遗传改造，再培养成类器官；
[0019]4)将步骤3)所得类器官注射到动物鼻咽部；
[0020]步骤3)所述遗传改造是指敲除抑癌基因，和/或过表达原癌基因。
[0021]如前述的方法，步骤2)用于培养类器官的培养基为前述的培养基。
[0022]如前述的方法，步骤1)包括：
[0023]a.使用终浓度0.25％胰酶消化鼻咽组织；
[0024]b.经80-130μm筛网过滤，收集滤液中的细胞；
[0025]c.使用细胞培养基中和滤液，终止消化；
[0026]d.400G，离心5min去除上清，再加入细胞培养基重悬细胞，再离心去除上清；
[0027]优选地，步骤b使用的100μm的滤网。
[0028]如前述的方法，步骤c和/或d中的细胞培养基是DMEM/F12培养基。
[0029]如前述的方法，步骤2)包括：
[0030]i.将细胞与30ul的Matrigel混合，待Matrigel凝固后，加入培养基进行培养，得到类器官；
[0031]ii.使用1X的TrypLE重悬类器官15min；
[0032]iii.加入细胞培养基洗涤细胞，终止消化；
[0033]iv.离心去除上清，加入细胞培养基重悬细胞，使细胞分散，离心；
[0034]v.加入30ul的Matrigel重悬细胞，待Matrigel凝固后，加入培养基培养，得到类器官。
[0035]如前述的方法，步骤3)的还包括对类器官转入荧光标记基因。
[0036]如前述的方法，步骤4)的基因编辑具体是：过表达cMYC基因、Kras G12D突变基因,敲除Cdkn2a基因；
[0037]所述鼻咽癌为低分化鳞癌。
[0038]如前述的方法，它还包括：
[0039]步骤5)：每2-3周进行活体成像观察，检测肿瘤形成情况。
[0040]如前述的方法，步骤1)和4)所述动物是小鼠。
[0041]本专利技术的方法具有如下有益效果：
[0042]1)相比肿瘤细胞系移植瘤模型以及人源异种移植瘤模型，本专利技术的方法构建得到的模型不需使用免疫缺陷动物，且为原位肿瘤，可模拟在人体内由于遗传改变导致正常细胞向肿瘤细胞转化的过程，能动态地表征了肿瘤发生发展地过程，在基因层面、肿瘤微环境、肿瘤发展及病理生理等方面与肿瘤发生发展真实情况更加贴近。
[0043]2)相比基因工程动物模型，本专利技术的肿瘤模型构建方法不需要从受精卵或胚胎开始构建，其周期能显著缩短，且不会出现全身基因突变导致的动物提前死亡的问题。
[0044]3)本专利技术的肿瘤模型构建方法成功率较高，可达75％。
[0045]显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0046]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
附图说明
[0047]图1：构建小鼠原位原发鼻咽肿瘤流程示意图。
[0048]图2：新鲜小鼠鼻咽组织经胰酶消化成单细胞后在Martrilgel中培养第1-11天生长状况。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种培养人或动物鼻咽组织细胞类器官的培养基，其特征在于，配方如下：B2750
±
5倍浓度稀释N-acetylcysteine1
±
0.1mMEGF50
±
5ng/mLNoggin100
±
10ng/mLR-spondin 1250
±
25ng/mLA83-01200
±
20nMFGF10500
±
50ng/mLNicotinamide10
±
1mMY-2763210
±
1uMWNT3a25
±
2.5ng/mLGlutamax100
±
10倍浓度稀释N2100
±
10倍浓度稀释Gastrin1
±
0.1nM。2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基的配方为：B2750倍浓度稀释N-acetylcysteine1mMEGF50ng/mLNoggin100ng/mLR-spondin 1250ng/mLA83-01200nMFGF10500ng/mLNicotinamide10mMY-2763210uMWNT3a25ng/mLGlutamax100倍浓度稀释N2100倍浓度稀释Gastrin1nM。3.一种构建原位原发鼻咽癌动物模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)人或动物鼻咽组织细胞原代培养；2)将细胞固定在Matrigel内，加培养基培养成类器官；3)将类...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈崇，刘玉，万旭东，王健，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：