一种仿生三维神经血管单元直接接触共培养体系及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种仿生三维神经血管单元直接接触共培养体系，至少包括神经元

【技术实现步骤摘要】
一种仿生三维神经血管单元直接接触共培养体系及其构建方法


[0001]本专利技术涉及细胞三维培养
，具体涉及仿生三维神经血管单元直接接触共培养体系及其构建方法。

技术介绍

[0002]神经血管单元(neurovascular unit,NVU)主要由血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)、星形胶质细胞(astrocyte)和神经元(Neuron)构成(图1)。主要有血脑屏障、营养偶联和电生理偶联等生理功能。
[0003]其中血管内皮细胞与星形胶质细胞共同参与形成血脑屏障(blood
‑
brain barrier,BBB)，能够有效限制血液中的物质进入中枢神经系统，这种血脑屏障作用对维持中枢神经系统内环境稳态起着重要作用。
[0004]神经血管单元具有营养偶联功能。体内血管内皮细胞、星形胶质细胞和神经元形成直接接触的多细胞复合体结构(图1)。血管内皮细胞从血液呈递营养物质进入脑组织，同时调控星形胶质细胞释放脑源性神经营养因子(brain
‑
derived neurotrophic factor，BDNF)和胶质细胞系来源的神经营养因子(Glial Cell Line
‑
derived Neurotrophic Factor，GDNF)等生长因子，进而促进神经元等细胞生长。星形胶质细胞能通过血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)促进内皮细胞生长，还能够将内皮细胞呈递的营养传递给神经元，同时具有维护中枢神经系统内微环境稳定等功能。
[0005]神经血管单元还具有电生理偶联功能。体内由血管内皮细胞、星形胶质细胞和神经元形成的直接接触多细胞复合体(图1)能够实现细胞间直接通讯。信号分子和神经电信号能够在不同细胞间直接传递，结合细胞间间接通讯功能实现神经调控、血管再生、血管收缩舒张等一系列生理功能。
[0006]神经血管单元的这些生物学功能依赖其独立分层的全链条细胞间直接通讯的结构体系(图1)。因此，如何有效地在体外构建和维持血管内皮细胞、星形胶质细胞和神经元三种细胞之间独立分层的全链条细胞间直接通讯的结构联系，成为构建具有较全面生物学功能神经血管单元的神经组织工程的关键。
[0007]首先，现有的二维多细胞神经血管单元直接接触共培养体系的构建方法是将血管内皮细胞、星形胶质细胞和神经元等各种细胞混杂在一起进行共培养，虽然能够形成各个细胞间的直接相互通讯联系，但是，无法模拟体内神经血管单元的独立分层结构，从而不能有效模拟神经血管单元的生物学功能，同时难以选择性检测共培养体系中某一类型细胞的功能和代谢情况。第二，现有的transwell单层膜的直接接触共培养系统，只能制备出两层细胞直接通讯的独立分层结构体系，如血管内皮细胞
‑
星形胶质细胞、星形胶质细胞
‑
神经元等独立分层结构，其余细胞需要接种于培养皿板底，形成间接接触，只能通过间接通讯方式进行细胞间通讯，或与某一种细胞混合种植在一起进行混合细胞共培养，只能形成血管内皮细胞
‑
星形胶质细胞
‑
神经元三种细胞之间部分分层结构或部分直接接触的共培养结
构体系，从而难以构建出具有全部独立分层结构且同时能够实现全链条细胞间直接通讯联系的直接接触神经血管单元模型，不能有效模拟体内神经血管单元的血脑屏障、营养偶联和电生理偶联等生理功能。第三，目前涉及神经血管单元的研究大多局限于神经血管单元细胞培养技术的完善，缺乏对构建神经血管单元各种细胞之间独立分层直接接触连接结构的方法学研究。
[0008]总之，现有的神经血管单元体外共培养细胞模型都存在各自的不足，难以全面有效地模拟体内神经血管单元的生理功能。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的之一在于提供一种仿生三维神经血管单元直接接触共培养体系。
[0010]本专利技术的目的之二在于提供一种仿生三维神经血管单元直接接触共培养体系的培养方法。
[0011]本专利技术的目的之三在于提供一种仿生三维神经血管单元直接接触共培养体系的构建方法。
[0012]本专利技术目的之一通过以下技术方案实现：一种仿生三维神经血管单元直接接触共培养体系，至少包括神经元
‑
半透膜
‑
三维培养星形胶质细胞
‑
半透膜
‑
血管内皮细胞，三维培养星形胶质细胞与半透膜
‑
血管内皮细胞复合体的非血管内皮细胞侧相贴，且与半透膜
‑
神经元复合体的非神经元细胞侧相贴，形成至少包括血管内皮细胞、三维培养星形胶质细胞和神经元的独立分层的全链条细胞间直接通讯的仿生三维神经血管单元直接接触共培养体系。
[0013]本专利技术目的之二通过以下技术方案实现：上述仿生三维神经血管单元直接接触共培养体系的培养方法，将装有的仿生三维神经血管单元直接接触共培养体系的培养小室置于装有培养基的培养皿中，然后置于37℃孵育箱进行培养，并每24小时进行培养基换液。
[0014]所述培养基至少包括等容量比的神经元培养基、星形胶质细胞培养基和血管内皮细胞培养基。
[0015]对于原代神经元，所述神经元培养基为包含Neurobasal
‑
A medium、B27、2nM谷氨酰胺以及1％青霉素/链霉素；对于神经元细胞系，所述神经元培养基为包含10％FBS、DMEM/F
‑
12培养基以及1％青霉素/链霉素。
[0016]对于原代星形胶质细胞和星形胶质细胞系,所述星形胶质细胞培养基均为包含10％FBS、DMEM/F
‑
12培养基以及1％青霉素/链霉素。
[0017]对于原代血管内皮细胞，所述血管内皮细胞培养基包含ECM培养基、血管内皮细胞生长因子、5％FBS以及1％青霉素/链霉素；对于血管内皮细胞系，所述血管内皮细胞培养基包含10％FBS、DMEM/F
‑
12培养基以及1％青霉素/链霉素。
[0018]本专利技术目的之三通过以下技术方案实现：一种仿生三维神经血管单元直接接触共培养体系的构建方法，包括以下步骤：
[0019](1)取第一个半透膜培养装置，在其培养小室底部设置的可拆装的半透膜上种入神经元，培养至神经元成熟，获得神经元
‑
半透膜复合体；
[0020](2)取第二个半透膜培养装置，在其培养小室底部设置的可拆装的半透膜上种入血管内皮细胞，培养至血管内皮细胞成熟，获得血管内皮细胞
‑
半透膜复合体；
[0021](3)任意选取血管内皮细胞
‑
半透膜复合体或神经元
‑
半透膜复合体，于该细胞
‑
半透膜复合体的无细胞侧，接种星形胶质细胞水凝胶混悬液；待星形胶质细胞水凝胶凝集粘附，将另外一个细胞
‑
半透膜复合体的无细胞侧贴合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种仿生三维神经血管单元直接接触共培养体系，其特征是，至少包括神经元
‑
半透膜
‑
三维培养星形胶质细胞
‑
半透膜
‑
血管内皮细胞，三维培养星形胶质细胞与半透膜
‑
血管内皮细胞复合体的非血管内皮细胞侧相贴，且与半透膜
‑
神经元复合体的非神经元细胞侧相贴，形成血管内皮细胞、三维培养星形胶质细胞和神经元的直接接触共培养体系。2.权利要求1所述的仿生三维神经血管单元直接接触共培养体系的培养方法，其特征是，将装有的仿生三维神经血管单元直接接触共培养体系的培养小室置于装有培养基的培养皿中，然后置于37℃孵育箱进行培养，并每24小时进行培养基换液。3.根据权利要求2所述的仿生三维神经血管单元直接接触共培养体系的培养方法，其特征是，所述培养基至少包括等容量比的神经元培养基、星形胶质细胞培养基和血管内皮细胞培养基。4.根据权利要求3所述的仿生三维神经血管单元直接接触共培养体系的培养方法，其特征是，对于原代神经元，所述神经元培养基为包含Neurobasal
‑
Amedium、B27、2nM谷氨酰胺以及1％青霉素/链霉素；对于神经元细胞系，所述神经元培养基为包含10％FBS、DMEM/F
‑
12培养基以及1％青霉素/链霉素。5.根据权利要求3所述的仿生三维神经血管单元直接接触共培养体系的培养方法，其特征是，对于原代星形胶质细胞和星形胶质细胞系,所述星形胶质细胞培养基均为包含10％FBS、DMEM/F
‑
12培养基以及1％青霉素/链霉素。6.根据权利要求3所述的仿生三维神经血管单元直接接触共培养体系的培养方法，其特征是，对于原代血管内皮细胞，所述血管内皮细胞培养基包含ECM培养基、血管内皮细胞生长因子、5％FBS以及1％青霉素/链霉素；对于血管内皮细胞系，所述血管内皮细胞培养基包含10％FBS、DMEM/F
‑
12培养基以及1％青霉素/链霉素。7...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕田明，张嘉发，
申请(专利权)人：张嘉发，
类型：发明
国别省市：