靶向CD33的嵌合抗原受体和制备B16-CD33CAR-NK细胞的方法技术

本发明专利技术涉及靶向CD33的嵌合抗原受体和制备B16

【技术实现步骤摘要】
靶向CD33的嵌合抗原受体和制备B16
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CD33 CAR
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NK细胞的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种分泌CD16抗体的CD33 CAR
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NK细胞，本专利技术还涉及此CAR
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NK细胞如B16
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CD33 CAR
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NK细胞的制备方法及其用途。

技术介绍

[0002]造血干细胞移植可以延长急性髓系白血病(AML)患者的生存期，但约20％的患者由于耐药仍不能达到完全缓解。针于复发/难治的(R/R)AML患者，几种新药和细胞疗法已被采用，包括去甲基化药，组蛋白去乙酰化酶抑制剂，免疫调节药物，靶向酪氨酸激酶抑制剂和嵌合抗原受体修饰(CAR)
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T。CAR
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T在AML中的治疗受限，主要原因是AML中存在的抗原(如CD33)可以被CAR
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T细胞高度靶向识别杀伤，但也在正常髓系细胞和造血干细胞中表达。因此，CAR
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T细胞靶向这些抗原可能导致严重的清髓毒性[Gill S,Tasian SK,Ruella M,Shestova O,Li Y,Porter DL,Carroll M,Danet
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Desnoyers G,Scholler J,Grupp SA,June CH,Kalos M.Pre
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clinical targeting of human acute myeloid leukemia and myeloablation using chimeric antigen receptor
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modified T cells.Blood 2014；123:2343
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54]，以及其他不良反应：脱靶效应、细胞因子释放综合征和神经毒性。自然杀伤细胞(NK)能抑制人恶性血液肿瘤生长，具有抗肿瘤的能力，是先天免疫系统的关键。NK细胞活性受激活和抑制受体的调节，这些受体的平衡将决定NK细胞对健康或恶性细胞的反应，包括“自我”保持沉默(耐受)、自身反应性或细胞毒性(同种异体反应性)。NK细胞的功能可以通过以下途径实现：I)含有颗粒酶和穿孔素的溶酶体脱颗粒后，对肿瘤靶细胞产生自然的细胞毒性；II)细胞因子如干扰素γ(IFN
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γ)和肿瘤坏死因子α(TNF
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α)帮助形成适应性免疫反应；和，III)通过CD16，有效的低亲和力FcγRIII受体，介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
[0003]研究已经证明了通过CD16和单克隆治疗性抗体操纵NK细胞的治疗潜力，可将肿瘤细胞上的表面抗原与细胞毒性淋巴细胞(如NK细胞)的效应细胞受体连接起来，从而产生抗肿瘤作用。CD16xCD33BiKE包含两个抗体片段，第一个识别CD16(FcγRIII)，第二个针对骨髓分化抗原CD33，它们共同触发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。此外，CD16xCD33 BiKE已被证明能克服KIR信号传导的抑制作用，提高NK对AML的杀伤。B16
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CD33 CAR的质粒构建原件中将CD16 VHH的氨基酸序列与CD33scFv串联，可以在两个方面增加NK细胞基础上的免疫治疗作用：1)作为肿瘤部位的锚定分子，募集NK细胞，使得局部NK细胞数量增加，延长肿瘤细胞与NK的接触时间，增强NK细胞的杀伤作用；2)在肿瘤部位激活NK细胞，进而杀伤肿瘤细胞。
[0004]本领域仍然期待有能够克服现有构建CAR
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NK细胞技术中的缺陷的改进的肿瘤治疗的方法，例如通过提供一种具有优良性能的分泌CD16抗体的CD33 CAR
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NK细胞来治疗肿瘤，为此，本领域技术人员期待有制备CAR
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NK细胞的新方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有构建CAR
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NK细胞技术中的缺陷，改进肿瘤治疗的方法，例如通过提供一种具有优良性能的分泌CD16抗体的CD33 CAR
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NK细胞，以期来治疗肿瘤；进而，制备CAR
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NK细胞的新方法亦是本专利技术的目的之一。
[0006]针对目前CAR
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NK技术实际需求，本专利技术提供了共表达CD16抗体的CD33 CAR
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NK表达质粒的构建，从而不仅能够将CD16抗体分泌到NK细胞外，还能够起到结合NK细胞表面相应受体结合进一步加强NK细胞的ADCC。
[0007]本专利技术制得的CAR
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NK细胞亦可称为B16
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CD33 CAR
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NK细胞。
[0008]为达到上述至少一个目的，本专利技术采取以下技术方案。
[0009]本专利技术第一方面提供了一种嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)，其包括：
[0010]a)作为第一信号的抗原结合域、
[0011]b)跨膜结构域、
[0012]c)作为第二信号的细胞内传导结构域、以及
[0013]d)表达CD16抗体的第三信号域。
[0014]根据本专利技术第一方面的嵌合抗原受体，所述第一信号的抗原结合域，其包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。SEQ ID NO.1：EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTITDSNIHWVRQAPGQSLEWIGYIYPYNGGTDYNQKFKNRATLTVDNPTNTAYMELSSLRSEDTAFYYCVNGNPWLAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASESLDNYGIRFLTWFQQKPGKAPKLLMYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQTKEVPWSFGQGTKVEVKRTV。
[0015]根据本专利技术第一方面的嵌合抗原受体，所述表达CD16抗体的第三信号域，其包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。SEQ ID NO.2：EVQLVESGGGFVQAGESLTLSCTSSTLTFTPYRMAWYRQAPGKQRDLVADISSGDGRTTNYADFAKGRFTISRDNIKNTVFLRMTNLKPEDTAVYYCNTFVSFVGIARSWGQGTQVTVSS。
[0016]本专利技术第二方面提供了制备CAR
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NK细胞的方法，其包括以下步骤：
[0017]1、质粒合成：
[0018]使用载体pLVX合成B16
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CD33 CAR
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NK质粒，该质粒由CD33单链可变区、铰链区、跨膜区、4
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1BB信号、CD3ζ的包浆信号、B16抗体构成；
[0019]2、病毒包装：
[0020]将步骤1构建的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.制备CAR
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NK细胞的方法，其包括以下步骤：(1)质粒合成：使用载体pLVX合成B16
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CD33 CAR
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NK质粒，该质粒由CD33单链可变区、铰链区、跨膜区、4
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1BB信号、CD3ζ的包浆信号、B16抗体构成；(2)病毒包装：将步骤1构建的B16
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CD33 CAR
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NK质粒，以及病毒包装质粒BaEV
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gp和病毒包装质粒SPAX2三者按5：1.5：3.5的比例与LipoFiter 3.0脂质体转染试剂共孵育后转染至293T细胞，至融合度达70％～85％，转染后6h更换DMEM完全培养基；(3)病毒收获及浓缩：分别在48小时和72小时，收集细胞培养上清液，在4℃下4000rpm离心15min后取上清，0.45μm滤膜过滤，以22000rpm超速离心2小时后弃上清，用新鲜的DMEM培养基重悬沉淀，得到病毒浓缩液，备用；(4)NK细胞的制备：取20ml的Ficoll淋巴细胞分离液于离心管中，将采集的外周血20ml于Ficoll液面上方1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上层；在4℃下500g离心15min，离心后从管底至液面依次分为4层：红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层即白膜层、血浆层；用移液管直接吸去上层的血浆，轻轻吸出单个核细胞层，放入新的离心管中，用PBS悬浮至40ml，在4℃下500g离心5min，重复两次以清洗细胞；用PBS重悬细胞沉淀并计数，将细胞密度调整至1*107个细胞/ml；取5*107个细胞加入100μL的CD3 Microbeeds重悬，4
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8℃孵育15min；将LS磁珠分选柱置于磁力架上，使用2ml PBS冲洗LS柱后，将孵育后的细胞悬液加入到LS柱里，使之流到50ml离心管，作为要收集的细胞；用PBS洗两遍，计数后取2*107单个核细胞备用；复苏NK细胞扩增试剂中的滋养层细胞，然后放入盛有10ml完全培养基即NK细胞无血清培养基的T
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75培养瓶中，再将刚制备好的单个核细胞加入T
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75培养瓶中混合培养，培养3天，为NK细胞；所述NK细胞无血清培养基增补有5...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘庆喜，肖海蓉，魏卿，
申请(专利权)人：深圳博雅感知药业有限公司，
类型：发明
国别省市：